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易基因｜DNA甲基化揭示應(yīng)激反應(yīng)影響嬰兒免疫相關(guān)基因的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制 | 表觀發(fā)育 大家好，這里是專(zhuān)注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。 2021年，《Brain, Behavior, and Immunity》雜志發(fā)表題為“Biobehavioral organization shapes the immune epigenome in infant rhesus Macaques (Macaca mulatta)”的研究論文，該研究通過(guò)簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）等實(shí)驗(yàn)揭示生物行為組織塑造恒河猴仔猴的免疫表觀基因組特征。
標(biāo)題：Biobehavioral organization shapes the immune epigenome in infant rhesus Macaques (Macaca mulatta) 時(shí)間：2021.08 期刊：Brain, Behavior, and Immunity 影響因子：IF 19.227 技術(shù)平臺(tái)：RRBS 樣本實(shí)驗(yàn)：154只3-4個(gè)月齡的恒河猴仔猴（82只雄性）
圖1：數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)收集和分析各階段的甲基化數(shù)據(jù)和主要自變量（籠子觀察量表、人類(lèi)入侵者量表、皮質(zhì)醇樣品）流程圖。縮寫(xiě)：IV表示Independent variable，自變量。
如何應(yīng)對(duì)壓力與其健康狀況息息相關(guān)。據(jù)推測(cè)，早期應(yīng)激反應(yīng)有助于促進(jìn)發(fā)育機(jī)體健康，但應(yīng)激反應(yīng)與發(fā)育過(guò)程中早期免疫功能之間的關(guān)系尚不清楚。本研究首先假設(shè)應(yīng)激反應(yīng)可能影響嬰兒期免疫基因的表觀遺傳調(diào)控，為此，作者研究了154只恒河猴仔猴（3-4個(gè)月大）的行為反應(yīng)和下丘腦-垂體-腎上腺應(yīng)激反應(yīng)是否與表觀基因組免疫細(xì)胞DNA甲基化模式相關(guān)。在標(biāo)準(zhǔn)化的生物行為評(píng)估過(guò)程中收集仔猴的行為和生理反應(yīng)，包括臨時(shí)遷移及與猴媽媽和社會(huì)群體分離。利用簡(jiǎn)化基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）從分離后2小時(shí)內(nèi)收集的血液DNA進(jìn)行全基因組DNA甲基化定量分析。通過(guò)簡(jiǎn)單回歸、控制免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的多元回歸和置換回歸（permutation regression）進(jìn)行表觀基因組分析（均校正錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）。在分析的變量中鑒定出20368個(gè)特異性位點(diǎn)（在9040個(gè)基因中）甲基化與三種分析中的至少一種行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇檢測(cè)顯著相關(guān)。免疫系統(tǒng)過(guò)程本體（ontology）類(lèi)別中的442個(gè)基因與趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)基因通路介導(dǎo)的炎癥中94個(gè)基因存在顯著關(guān)聯(lián)。在用于進(jìn)一步研究的35個(gè)候選基因中，有13個(gè)基因具有至少一個(gè)甲基化與行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇顯著相關(guān)的位點(diǎn)，包括糖皮質(zhì)激素受體基因中的兩個(gè)內(nèi)含子位點(diǎn)。在社會(huì)分離后，甲基化與第二天情緒行為（第2天情緒，β=?0.39，q<0.001）和皮質(zhì)醇反應(yīng)（樣本1；β=?0.33，q<0.001）呈負(fù)相關(guān)?？傊Y(jié)果表明，生物行為應(yīng)激反應(yīng)可能與表觀基因組發(fā)育有關(guān)，免疫細(xì)胞DNA甲基化可能是應(yīng)激反應(yīng)模式影響健康和免疫功能的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。 研究亮點(diǎn)：
研究結(jié)果 （1）免疫系統(tǒng)過(guò)程和炎癥通路基因研究
表1：免疫系統(tǒng)過(guò)程注釋類(lèi)別中甲基化與行為反應(yīng)、甲基化與皮質(zhì)醇之間的選定關(guān)聯(lián)。 該表顯示免疫系統(tǒng)過(guò)程注釋類(lèi)別（PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)）中與簡(jiǎn)單線性回歸、免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的多元回歸控制和置換回歸中的行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇顯著相關(guān)位點(diǎn)匯總，僅顯示啟動(dòng)子附近區(qū)域位點(diǎn)。
圖2：免疫相關(guān)注釋類(lèi)別中的選定的感興趣的關(guān)聯(lián)。 該圖顯示了免疫系統(tǒng)過(guò)程中的生物過(guò)程注釋類(lèi)別（圖A左）和趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥中與轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)的基因組區(qū)域（圖B右）中三個(gè)選定位點(diǎn)的原始數(shù)據(jù)，β值表示所示自變量和因變量之間關(guān)聯(lián)的簡(jiǎn)單回歸的β權(quán)重。縮寫(xiě)：D1 Emo表示第1天情緒；HI Act表示人類(lèi)入侵者活動(dòng)；HI Agg表示人類(lèi)入侵者攻擊；Samp3表示皮質(zhì)醇樣品3（分離后23.5小時(shí)，地塞米松后16.5小時(shí)）；Samp1表示皮質(zhì)醇樣品1（分離后2小時(shí)）。
表2：由趨化因子和細(xì)胞因子信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥中甲基化和行為反應(yīng)以及甲基化和皮質(zhì)醇之間選定的感興趣的關(guān)聯(lián)。 僅顯示5'UTR、3’UTR和啟動(dòng)子附近及下游區(qū)域的位點(diǎn)（啟動(dòng)子200、啟動(dòng)子1500、下游200、下游1500） （2）PANTHER過(guò)表達(dá)分析
圖3：顯著過(guò)表達(dá)的PANTHER生物過(guò)程。該圖顯示了在所分析的自變量中顯著過(guò)表達(dá)的PANTHER生物學(xué)通路（FDR q<0.05）?？s寫(xiě)：D1 Emo和D2 Emo表示第1天和第2天情緒；HI Agg表示人類(lèi)入侵者攻擊；HI-Disp表示人類(lèi)入侵者遷移；HI Emo表示人類(lèi)入侵者情緒；Eosin表示嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。
表3：與行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇顯著相關(guān)位點(diǎn)的六個(gè)過(guò)表達(dá)PANTHER的GO通路分析 該表顯示了在簡(jiǎn)單回歸、免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)的多元回歸控制和分析的每個(gè)自變量的置換回歸中的全基因組顯著性位點(diǎn)的過(guò)表達(dá)分析匯總。僅顯示了相對(duì)于恒河猴參考基因組和分析的位點(diǎn)子集顯著過(guò)表達(dá)通路。Pathway列表示過(guò)表達(dá)的PANTHER基因通路。IV列表示該通路在與特定自變量顯著相關(guān)位點(diǎn)中顯著過(guò)表達(dá)。Number of Sig. Genes in Pathway列表示具有至少一個(gè)在該位點(diǎn)甲基化與所示自變量顯著相關(guān)位點(diǎn)的特異性基因數(shù)量。Total in Pathway列表示在分析的數(shù)據(jù)中（或括號(hào)中的恒河猴參考基因組中）該通路中有多少基因。Expected in Pathway列表示通路中偶然預(yù)期顯著命中的基因數(shù)量。Fold Enrichment表示通路中觀察到的顯著命中的數(shù)量超過(guò)預(yù)期基因數(shù)的程度。并非所有有顯著意義的位點(diǎn)都在PANTHER基因通路中進(jìn)行了注釋?zhuān)贏ttained Sig列中顯示的數(shù)字對(duì)應(yīng)于基因通路中注釋的重要位點(diǎn)數(shù)量。FDR q列表示二項(xiàng)式比例檢驗(yàn)的過(guò)表達(dá)p值，并根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率進(jìn)行校正。
圖4：第1天情緒與通過(guò)血管緊張素II 刺激G蛋白和β-抑制蛋白通路的信號(hào)傳導(dǎo)中兩個(gè)選定位點(diǎn)甲基化之間的關(guān)聯(lián)原始數(shù)據(jù)。其中甲基化與第1天情緒相關(guān)。β值表示所示自變量和因變量之間關(guān)聯(lián)的簡(jiǎn)單回歸β權(quán)重?？s寫(xiě)：D1-Emo第1天情緒。 （3）特定候選基因研究
圖5：特定目標(biāo)候選基因的原始數(shù)據(jù)。該圖顯示了四個(gè)候選基因的原始數(shù)據(jù)，其中甲基化與行為反應(yīng)或皮質(zhì)醇顯著相關(guān)。β值表示所示自變量和因變量之間關(guān)聯(lián)的簡(jiǎn)單回歸β權(quán)重。 （4）免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)分析
圖6：全基因組特異性和重疊位點(diǎn)以及跨位點(diǎn)基因的數(shù)量。 結(jié)論： 本研究通過(guò)RRBS等實(shí)驗(yàn)在恒河猴表觀基因組中鑒定出20368個(gè)與應(yīng)激狀態(tài)的行為或生理反應(yīng)相關(guān)的特異性位點(diǎn)。研究結(jié)果表明，應(yīng)激反應(yīng)與免疫系統(tǒng)功能和炎性反應(yīng)的表觀遺傳調(diào)控相關(guān)聯(lián)。本研究為人類(lèi)和恒河猴的甲基化-氣質(zhì)關(guān)聯(lián)的表觀基因組研究提供了有利證據(jù)。作者推測(cè)，早期生活應(yīng)激反應(yīng)的個(gè)體差異可能會(huì)對(duì)免疫表觀基因組產(chǎn)生編程效應(yīng)，從而影響后期的健康結(jié)果。需要繼續(xù)研究以探索這些表觀遺傳特征是如何在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)，以及其在個(gè)體健康和疾病差異中的作用。 關(guān)于易基因簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序研究解決方案 簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，富集啟動(dòng)子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測(cè)序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測(cè)序深度，在CpG島、啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。 為適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點(diǎn)的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。 為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開(kāi)發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化靶向基因組測(cè)序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和微量樣本復(fù)用檢測(cè)，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個(gè)細(xì)胞基因組CG位點(diǎn)覆蓋高達(dá)15M以上。 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
應(yīng)用方向： RRBS/dRRBS/XRBS廣泛應(yīng)用于動(dòng)物，要求全基因組掃描（覆蓋關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)）的：
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參考文獻(xiàn)： Baxter A, Capitanio JP, Bales KL, Kinnally EL. Biobehavioral organization shapes the immune epigenome in infant rhesus Macaques (Macaca mulatta). Brain Behav Immun. 2021 Aug;96:256-270. 相關(guān)閱讀： 3文一覽：DNA甲基化在水稻植物生長(zhǎng)發(fā)育的表觀遺傳分子基礎(chǔ)研究 Genome Biol：DNA甲基化在玉米籽粒發(fā)育表觀調(diào)控作用的研究新進(jìn)展 疾病研究：DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征在高漿卵巢癌復(fù)發(fā)和耐藥過(guò)程中高度保守 性別分化：DNA甲基化表觀遺傳調(diào)控性別表型可塑性，誘導(dǎo)斑馬魚(yú)性別比例失調(diào) DNA甲基化揭示應(yīng)激反應(yīng)影響嬰兒免疫相關(guān)基因的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制 | 表觀發(fā)育
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