通過腺相關病毒（AAV）遞送CRISPR基因編輯工具，為開發(fā)永久性逆轉(zhuǎn)致病基因缺陷的療法提供了巨大潛力。通過這種方式來靶向并敲入正?；蛐蛄幸曰謴突蚬δ埽挥霉芡蛔冾愋?，因此是一種很有吸引力的基因治療策略。

然而，想實現(xiàn)AAV-CRISPR有效在體內(nèi)細胞中的基因敲入，通常需要遞送高劑量AAV，這會帶來潛在安全風險，而且大大增加生產(chǎn)成本。

近日，香港中文大學馮波團隊在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：Low-dose AAV-CRISPR-mediated liver-specific knock-in restored hemostasis in neonatal hemophilia B mice with subtle antibody response 的研究論文。

研究團隊系統(tǒng)研究了AAV-CRISPR介導的體內(nèi)NHEJ基因敲入，實現(xiàn)了有效且更低和更安全劑量的AAV劑量，在成年和新生小鼠血友病B型模型中實現(xiàn)了有效的人源F9基因敲入，恢復了凝血因子Ⅸ的表達，從而恢復了血友病B型小鼠的凝血功能。

值得一提的是，在接受低劑量AAV-CRISPR的新生小鼠中，抗Cas9和抗AAV的血漿抗體幾乎可以忽略不計，這為AAV-CRISPR介導的體細胞基因敲入治療遺傳性疾病提供了支持。

由凝血因子Ⅸ（由F9基因表達）突變引起的遺傳性血友病B型被廣泛用作疾病模型來研究基因敲入。通過同源定向修復（HDR）機制，使用AAV遞送的鋅指核酸酶（ZFN）在小鼠體內(nèi)敲入人F9基因外顯子（hF9 Ex2-8），使用AAV遞送的CRISPR-SaCas9敲入小鼠mF9 Ex2-8和高活性hF9 R338L變體。

除了同源定向修復（HDR），DNA的另一種修復機制非同源末端連接（NHEJ）最近也被用于基因敲入，與HDR相比，基于NHEJ的基因敲入效率更高。由于無需同源序列，在進行體內(nèi)基因編輯時，通過AAV遞送供體序列進行NHEJ基因敲入具有潛力更大，也更具靈活性。

迄今為止，通過基于HDR或NHEJ的策略，AAV遞送的體內(nèi)基因敲入的效果已在臨床前模型中得到廣泛證實。然而，有效的體內(nèi)基因敲入大多是以高劑量AAV為代價的，這會顯著增加潛在安全風險和生產(chǎn)成本。

在這項研究中，研究團隊在mAlb基因的3'UTR區(qū)域的新靶點進行了AAV-CRISPR介導的不依賴于同源序列的基因敲入。單劑AAV成功在成年和新生血友病B型小鼠中實現(xiàn)了人源F9基因的長期整合和表達，產(chǎn)生了高水平的人凝血因子因子Ⅸ（hFⅨ），并在整個48周的觀察期間穩(wěn)定地恢復凝血功能。

此外，研究團隊通過使用高活性hF9 R338L 變體的肝臟特異性基因敲入，以顯著降低的AAV劑量恢復了血友病B型小鼠的凝血功能（新生小鼠劑量為2×10E9 vg，成年小鼠為1×10E10 vg）。

在接受低劑量AAV-CRISPR的新生小鼠中，抗Cas9和抗AAV的血漿抗體幾乎可以忽略不計，這為AAV-CRISPR介導的體細胞基因敲入治療遺傳性疾病提供了支持。