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菌毒種 系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、真菌、支原體、放線菌、衣原體、立克次體或病毒等，包括各種經(jīng)過基因工程修飾的菌毒種。 ——生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制《中國藥典》2020年版 菌毒種作為重要的實(shí)驗(yàn)材料被廣泛應(yīng)用于診斷試劑、藥物篩選、疫苗及生物制品研發(fā)等領(lǐng)域，其質(zhì)量直接影響科研及生產(chǎn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，若使用的菌毒種有誤或者存在污染，將對結(jié)果造成嚴(yán)重影響；因此，菌毒種資源所對應(yīng)的信息準(zhǔn)確、完整與否，亦是生物制品質(zhì)量審評的重要關(guān)卡。 《中國藥典》規(guī)定，生物制品生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)，并應(yīng)盡量減少傳代次數(shù)，以降低發(fā)生遺傳變異的風(fēng)險(xiǎn)。工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代（從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代）；原始種子應(yīng)驗(yàn)明其歷史、來源（包括重組工程菌毒種的構(gòu)建過程）和生物學(xué)特性。美國藥典（USP）部分標(biāo)準(zhǔn)要求從保藏機(jī)構(gòu)獲取的菌毒種傳代不能超過5代。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）-M22-A3要求不能超過7代。 開展菌毒種質(zhì)量控制，對生產(chǎn)用菌毒種進(jìn)行生物學(xué)特性、生化特性、血清學(xué)試驗(yàn)和分子遺傳特性等的檢定，確保生產(chǎn)用菌毒種的檢定符合各論要求。  生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制《中國藥典》2020年版 以下主要介紹菌毒種鑒定中的分子生物學(xué)方法。 菌毒種鑒定 表型特征方法 表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來區(qū)別不同微生物間的差異，通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進(jìn)行鑒別。 表1 微生物分類中常用的表型特征
菌毒種鑒定 分子生物學(xué)方法 與表型特征不同，應(yīng)用分子生物學(xué)方法通常不受生長培養(yǎng)基或分離物活性的影響，只需分離到純菌落便可用于分析。由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，所以16S rRNA核酸測序、18S rRNA核酸測序、ITS核酸測序和全基因組核酸測序等“系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)”鑒定方法理論上更值得信賴。 表2 微生物分類學(xué)的基因型/系統(tǒng)發(fā)育的特征
細(xì)菌16S rRNA基因序列和真菌的ITS核酸序列在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守性，是微生物核酸測序鑒定和分類中廣泛應(yīng)用的DNA特征性核酸序列，方法易標(biāo)準(zhǔn)化，鑒定結(jié)果可以滿足一般菌種鑒定的要求。對16S rRNA（全長約1500bp）和ITS（ITS1與ITS2）全長序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物后純化，純化產(chǎn)物使用sanger法進(jìn)行序列測定，然后與公用數(shù)據(jù)庫（NCBI）進(jìn)行比對，進(jìn)行菌種鑒定。 不過16S rRNA等標(biāo)簽基因，一般能夠鑒定到種的級(jí)別，若是確認(rèn)同種中的兩個(gè)相同株需要比對更多的基因序列或特征基因片段，甚至是全基因組序列的比對來保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。  16S F端測序峰圖示例  16S R端測序峰圖示例  全基因組核酸測序可以得到菌株核酸水平的全部遺傳信息，通過核酸序列的比對分析，進(jìn)行菌株的鑒定、功能挖掘及安全性評價(jià)等分析。2020 版《中國藥典》人用基因治療制品總論要求應(yīng)保證起始原材料的遺傳穩(wěn)定性，并基于細(xì)胞庫/種子批經(jīng)長時(shí)間培養(yǎng)或多次傳代后產(chǎn)物的完整性和一致性。在特定情況下因某些位點(diǎn)產(chǎn)生突變造成序列與理論不符，應(yīng)提供不影響目的基因表達(dá)和制品質(zhì)量的證據(jù)。全基因組核酸序列檢測方法對遺傳變異的分析能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)尚未導(dǎo)致表型改變、但核酸已發(fā)生變異的情況，從而進(jìn)行處置，避免因菌毒種變異而影響實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。 食品和飼料安全基因組學(xué)跨機(jī)構(gòu)合作組織編寫的“Use of Whole Genome Sequencing by the Federal Interagency Collaboration for Genomics for Food and Feed Safety in the United States”描述了美國國立衛(wèi)生研究院、衛(wèi)生與公眾服務(wù)部、疾病控制和預(yù)防中心（CDC）和美國食品和藥物管理局（FDA），以及美國農(nóng)業(yè)部、食品安全和檢驗(yàn)局、農(nóng)業(yè)研究局和動(dòng)植物衛(wèi)生檢驗(yàn)局之間的食源性病原體分析、調(diào)查和協(xié)調(diào)工作。指出使用單核苷酸多態(tài)性（SNP）方法評估基因內(nèi)（編碼）和基因間（非編碼）的變異，根據(jù)廣義的法則與WGS數(shù)據(jù)比對，≤20 SNPs 用于判定是否為同一菌株，且FDA在其GenomeTrakr nerwork中也是基于SNP的方法進(jìn)行菌株鑒定。 閱微基因菌毒種鑒定-全基因組測序方法，將待檢樣本與參考樣本比對，統(tǒng)計(jì)兩者間SNP/突變位點(diǎn)數(shù)量并判定是否為同一株系（≤20 個(gè)SNP位點(diǎn)判定為同一株系來源，>20個(gè)SNP位點(diǎn)判定為非同一株系）?？山邮諛颖绢愋蜑楹怂崤c菌種沉淀，病毒類樣本鑒定只接收核酸。
對SNP/突變位點(diǎn)的注釋，輔助判定突變是否會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物：
菌毒種的鑒定應(yīng)根據(jù)實(shí)際的需求以及所要達(dá)到的鑒定水平（屬、種、株），選擇最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時(shí)可采用多種鑒定方法進(jìn)行確認(rèn)。 質(zhì)量控制是產(chǎn)品安全、有效的重要保證和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)之一，閱微基因可提供細(xì)胞特性、功能性、純度、安全性等分析，從藥典推薦方法到快速檢測方法滿足不同階段的研發(fā)需求，同時(shí)為研發(fā)型藥企及CXO企業(yè)提供從質(zhì)控、基因分析到臨床基因分型方法的驗(yàn)證開發(fā)。 閱微基因質(zhì)控檢測項(xiàng)目表
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