動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）導致的心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是全球死亡的主要原因，世界衛(wèi)生組織預測2030年將有2 360萬人死于CVD[1]。AS形成機制復雜，主要涉及血管內(nèi)皮損傷、單核巨噬細胞黏附、脂質(zhì)沉積等[2]，但這些因素如何影響AS進程，其機制尚未完全清楚。因此找尋AS新的診斷靶點，預防AS的發(fā)生，延緩其進展尤為重要。利用基因芯片技術(shù)對臨床患者標本進行檢測分析，篩選出一些具有價值的基因，進而深入研究冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary artery disease，CAD）的發(fā)病機制具有重要的臨床意義。肥胖是CVD的獨立危險因素，但肥胖的主要評價指標體質(zhì)指數(shù)（BMI）與AS患者死亡率呈'U'型關(guān)聯(lián)，這種現(xiàn)象被稱為肥胖悖論，因此脂肪組織不再被認為是單純的'能量倉庫'，而是一種代謝活躍的內(nèi)分泌和旁分泌器官[3]。心外膜脂肪組織（epicardial adipose tissue，EAT）在解剖上與冠狀動脈緊密相連，同AS、心房顫動、心力衰竭等CVD密切相關(guān)[4,5,6]。多項研究發(fā)現(xiàn)功能失調(diào)的EAT通過分泌外泌體（exosome，EXO）和生物活性物質(zhì)促進AS疾病進展[7]，但其作用機制仍需進一步研究。本研究通過對美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）中CAD患者EAT和EXO的基因測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，探討EAT參與AS的分子機制及其與EXO的聯(lián)系，旨在為CAD的診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　數(shù)據(jù)集的下載與預處理

以'epicardial adipose tissue OR EAT'為關(guān)鍵詞，選擇'Homo sapiens'為研究對象檢索GEO數(shù)據(jù)庫，根據(jù)數(shù)據(jù)集提供的相關(guān)信息，獲得所需芯片GSE64554、GSE120774，根據(jù)臨床信息將EAT的測序數(shù)據(jù)分為CAD組和健康對照組。下載series matrix的數(shù)據(jù)，采用'sva'包'ComBat'方法去除批次效應(yīng)，合并基因表達矩陣。通過exoRBase 2.0數(shù)據(jù)庫獲取CAD組與健康對照組血液EXO基因表達譜。

1.2　差異基因的篩選

通過'limma'R語言包[8]對合并后數(shù)據(jù)集中CAD組與健康對照組EAT間差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）和CAD組與健康對照組EXO間DEGs進行篩選，以P<0.05為篩選條件，并將結(jié)果可視化為火山圖和熱圖。

1.3　加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）的構(gòu)建與CAD相關(guān)模塊的識別

為了防止合并數(shù)據(jù)集對基因關(guān)聯(lián)度的影響，使用'WGCNA'R語言包構(gòu)建GSE64554數(shù)據(jù)集基因共表達網(wǎng)絡(luò)并識別出模塊。選擇滿足無尺度網(wǎng)絡(luò)的標準軟閾值β構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)化拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix，TOM），采用動態(tài)剪枝法對模塊進行初步劃分。根據(jù)GSE64554數(shù)據(jù)集樣本臨床信息，決定納入的臨床信息包括疾病和年齡，得到相關(guān)性最高的模塊進行后續(xù)分析。計算基因與模塊的相關(guān)系數(shù)（module membership，MM）來評估基因與模塊之間的相關(guān)性，以|MM|>0.8篩選模塊內(nèi)樞紐基因（hub gene）。

1.4　基因功能的富集分析

通過'clusterProfiler'R語言包[9]將所獲基因進行富集分析，以FDR<0.05為篩選標準，進行通路富集分析。通過GO富集分析，得到所選基因所富集的生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular components，CC）及分子功能（molecular function，MF）。通過KEGG通路富集分析，得到所選基因所富集的信號通路。將所獲基因?qū)隡etascape在線數(shù)據(jù)庫[10]進行基因的富集分析以及轉(zhuǎn)錄因子預測。

1.5　蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與hub基因篩選

將所選基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https://）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將PPI網(wǎng)絡(luò)導入Cytoscape（Version 3.9.0）軟件[11]通過CytoHubba插件MCC算法獲得連接度最高的10個基因作為關(guān)鍵基因，并進行繪圖。

1.6　免疫細胞浸潤分析

在Cibersort網(wǎng)站（
https://cibersort./）下載22種免疫細胞的基因表達矩陣，采用Cibersort反卷積算法，計算GSE64554芯片中46個樣本的免疫細胞浸潤情況，并作圖對組織的免疫細胞浸潤情況進行比較。

1.7　臨床樣本的采集及實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）

選取山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院2021年6—10月行冠狀動脈造影患者20例，其中CAD患者及健康者各10例，留取外周血儲存在-80 ℃冰箱中備用。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，見表1。按照總RNA快速提取試劑盒（RP4001，百泰克公司）的說明提取血漿中的總RNA，cDNA的合成按照HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒的步驟進行，第一步去除總RNA中殘余的DNA，第二步反轉(zhuǎn)錄cDNA，得到的cDNA保存于-20 ℃冰箱。以cDNA為模板，進行qRT-PCR，反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s；60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃15 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。結(jié)果用2-ΔΔCT進行計算分析。

1.8　統(tǒng)計學方法

采用Excel對錄入整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的連續(xù)變量采用（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　CAD組與健康對照組EAT間的DEGs

2.1.1　DEGs的獲取

采用'limma'包獲取CAD組與健康對照組EAT間DEGs，以P<0.05作為篩選差異基因的閾值，得到差異表達的1 511個mRNA，其中表達上調(diào)956個，表達下調(diào)555個，見圖1、圖2。

2.1.2　EAT間DEGs的GO/KEGG富集分析與PPI網(wǎng)絡(luò)

對合并后CAD組較健康對照組EAT間DEGs進行GO富集分析，共獲得符合篩選條件的GO術(shù)語共800條，其中BP 567條，主要涉及細胞壓力反應(yīng)、細胞DNA損傷刺激反應(yīng)等。獲得CC 127條，主要涉及細胞質(zhì)基質(zhì)、MHC蛋白復合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔側(cè)的組成部分等。獲得MF 106條，主要涉及MHCⅡ類蛋白復合物、特殊核糖核酸酶激活等，見圖3。共富集到KEGG通路20個，主要涉及RNA降解、病毒性心肌炎、移植物抗宿主病、1型糖尿病等信號通路，見圖4。

將所獲EAT間DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，其中實際上有互作關(guān)系的節(jié)點有1 507個，有1 258條邊，每個節(jié)點的平均Degree為1.67分。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導入Cytoscape軟件，使用CytoHubba插件根據(jù)MCC算法得到連接度前10的基因并作圖，分別為RPS27A、PSME4、PSMA1、PSMA5、GLI3、GLI1、PSME2、PSMB9、SUFU和SHH，見圖5。

2.1.3　EAT間DEGs的Metascape富集分析

對合并后CAD組與健康對照組EAT間DEGs進行Metascape富集分析，發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于嗅覺轉(zhuǎn)導、細胞對DNA損傷刺激反應(yīng)、單純皰疹病毒1型感染、RNA代謝、調(diào)節(jié)細胞對壓力的反應(yīng)、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)等，TRRUST數(shù)據(jù)庫預測MHCⅡ反式激活蛋白（CIITA）轉(zhuǎn)錄因子可能參與了EAT間DEGs的調(diào)控，見圖6、圖7。

2.2　EAT組織的WGCNA分析

2.2.1　EAT組織WGCNA軟閾值的選擇與模塊的初步劃分

本研究最終以β=5作為軟閾值來構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置每個基因模塊中基因數(shù)目最小為30，設(shè)定基因的聚類高度上限為0.995。最終得到156個網(wǎng)絡(luò)模塊，模塊中的基因個數(shù)為30~2 169。根據(jù)拓撲重疊程度，制作模塊相關(guān)性圖，見圖8、圖9。

2.2.2　臨床信息關(guān)聯(lián)與hub基因的獲取

將各個劃分出的模塊與臨床信息進行關(guān)聯(lián)分析，得到與AS患者的EAT樣本臨床信息最為相關(guān)的模塊進行后續(xù)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS患者EAT與green4（r=0.50，P=0.02）、slateblue（r=0.54，P=8.0×10-3）、darkseagreen4（r=0.55，P=6.4×10-3）、darkolivegreen1（r=0.55，P=7.0×10-3）、sienna4（r=0.56，P=5.6×10-3）、brown3（r=0.57，P=4.2×10-3）模塊呈正相關(guān)，與deeppink（r=0.50，P=0.01）、lavender（r=0.60，P=2.6×10-3）、lavenderblush3（r=0.56，P=5.9×10-3）呈負相關(guān)，以|MM|>0.8篩選所選模塊內(nèi)hub基因，見圖10。

2.3　關(guān)鍵基因的獲得

將DEGs同模塊內(nèi)hub基因取交集，獲得差異表達的模塊內(nèi)hub基因，將其作為EAT組織參與AS病理生理過程的關(guān)鍵基因，其中上調(diào)hub基因為DDX47、FEM1C、NOL11、SRP54、ABI1、PATL1、BNIP2，下調(diào)hub基因為C1orf159、CHCHD4，見圖11。

2.4　免疫細胞浸潤分析

通過Cibersort反卷積算法，計算GSE64554芯片中CAD組和健康對照組EAT的免疫細胞浸潤情況。研究發(fā)現(xiàn)，CAD組EAT組織較健康對照組中初始CD4+ T細胞表達豐度升高（P=0.048），靜息樹突細胞表達豐度減低（P=0.044），見圖12、圖13。

2.5　CAD組與健康對照組EXO間DEGs

采用'limma'包選獲取CAD組與健康對照組EXO間DEGs，以P<0.05，|logFoldchange|>1作為篩選差異基因的閾值，共得到DEGs 1 658個，其中上調(diào)278個，下調(diào)1 380個，見圖14、圖15。

2.6　EAT來源EXO

將CAD組與健康對照組EAT、EXO間DEGs取交集并做Venn圖，共獲得129個基因，其中上調(diào)16個，下調(diào)113個，經(jīng)篩選，將BPI、BIRC5、CXCL12、RNASE1、F2R作為關(guān)鍵基因并通過qRT-PCR進行驗證，見圖16。

2.7　EAT來源EXO間DEGs的驗證

收集CAD組和健康對照組外周血，運用qRT-PCR驗證生物信息學分析所得的EAT來源EXO基因BPI、BIRC5、CXCL12、RNASE1、F2R的mRNA水平。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，CAD患者的5個所選基因的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中BPI、BIRC5、CXCL12和RNASE1的mRNA水平升高，F(xiàn)2R基因的mRNA水平下降（P<0.05），見表2。

3　討論

EAT作為一種特殊的脂肪組織，解剖結(jié)構(gòu)上緊貼冠狀動脈，在病理環(huán)境中其向炎癥表型轉(zhuǎn)化，通過分泌促炎細胞因子和EXO參與血管內(nèi)皮損傷、血管重塑、免疫細胞黏附等AS病理生理過程。EAT的炎性反應(yīng)是AS的全新診斷治療靶點[5]，OIKONOMOU等[12]通過影像組學技術(shù)將心外膜脂肪衰減系數(shù)（fat attenuation index，F(xiàn)AI）應(yīng)用于CAD患者的早期篩查，而目前已廣泛應(yīng)用于臨床的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2（sodium-dependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制劑達格列凈則可以通過減輕EAT炎癥而減少糖尿病患者心血管事件的發(fā)生率[13]，但EAT在CAD中的作用機制仍需進一步研究。

此次通過生物信息學分析的方法從數(shù)據(jù)集GSE64554和GSE120774中篩選出CAD組和健康對照組EAT間DEGs 1 511個，通過富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于細胞質(zhì)基質(zhì)、MHC蛋白復合物、MHCⅡ蛋白復合物、RNA降解、抗原加工和呈遞等。目前AS被認為是一種慢性炎癥性疾病，MCHⅡ作為T細胞的呈遞抗原，通過抗原識別、細胞活化、產(chǎn)生細胞因子等方式在炎癥過程和CAD進展中發(fā)揮作用[14]。通過Meatscape富集分析中的TRRUST數(shù)據(jù)庫，筆者預測到CIITA轉(zhuǎn)錄因子可能在EAT中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，CIITA通過其轉(zhuǎn)錄后修飾甲基化[15]、去乙?；痆16,17]調(diào)節(jié)MHCⅡ的轉(zhuǎn)錄而參與AS。通過免疫細胞浸潤分析本研究發(fā)現(xiàn)CAD患者EAT中幼稚CD4+ T細胞豐度升高，早在2015年IBORRA等[18]便指出可以通過觀察幼稚CD4+ T細胞的體外分化程度評估AS程度，GADDIS等[19]指出AS通過影響糖酵解而損害幼稚CD4+ T細胞功能。綜上所述，MHCⅡ在AS中發(fā)揮了重要作用，但其在CAD患者EAT中的作用和調(diào)控機制仍需進一步研究。

通過篩選CAD患者與健康對照組EAT間DEGs，構(gòu)建EAT組織WGCNA，獲得了DDX47、FEM1C、NOL11、SRP54、ABI1、PATL1、BNIP2、C1orf159、CHCHD4、RPS27A共10個基因作為EAT參與CAD病理生理過程的關(guān)鍵基因。目前僅有關(guān)鍵基因被發(fā)現(xiàn)在CVD中發(fā)揮作用，XIA等[20]通過生物信息學技術(shù)發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因RPS27A可能參與AS的病理過程，HUANG等[21]指出RPS27A基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)鍵基因且同幼稚CD4+ T細胞密切相關(guān)。LI等[22]發(fā)現(xiàn)MBNL1通過對ABI1的剪切調(diào)控AS中平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換。因此，關(guān)鍵基因仍需進一步進行細胞和動物實驗證明其在EAT中的差異表達以及相關(guān)功能。

內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、脂肪細胞和血小板來源的EXO通過轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、RNA、DNA和其他生物活性物質(zhì)在缺血再灌注損傷、血管鈣化、AS和心臟重塑中發(fā)揮了重要作用，已成為CAD的全新診斷治療靶點[23]。脂肪組織是循環(huán)中EXO的來源之一[24]，冠狀動脈血管周圍脂肪組織是一種特殊的EAT[25]，LIU等[26]發(fā)現(xiàn)血管周圍脂肪組織來源EXO中miR-382-5p通過ABCA1/ABCG1信號通路調(diào)節(jié)泡沫巨噬細胞形成。LI等[27]發(fā)現(xiàn)血管周圍脂肪組織來源EXO中miR-221-3p通過介導血管重塑參與AS。ZHAO等[7]發(fā)現(xiàn)芒果苷誘導血管周圍脂肪組織衍生的EXO可以改善AS中的內(nèi)皮功能障礙，因此EAT來源EXO在AS中的作用具有重要的研究價值。

為進一步探討EAT在CAD中的作用機制，本研究將CAD患者與健康對照組的EAT間DEGs、EXO間DEGs取交集，共獲得129個基因，并篩選表達程度較高、有意義的基因RNASE1、BPI、BIRC5、CXCL12、F2R。其中前４個基因為CAD患者中上調(diào)基因。RNASE1是一種可分泌的耐熱蛋白，具有強大的心臟保護功能[28]，其通過保護內(nèi)皮細胞在炎癥中的損傷而成為血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控者[29]，在CAD中，EAT可能通過EXO釋放RNASE1進而調(diào)節(jié)冠狀動脈內(nèi)皮細胞的炎性損傷。血管生成趨化因子介導細胞趨化、白細胞脫粒和血管生成，CXCL-12同AS密切相關(guān)[30]，其通過CXCL-12-CXCR4軸參與平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化保護血管穩(wěn)態(tài)[31]，特異性過表達巨噬細胞IGF-1通過減少CXCL-12介導的單核細胞募集和增加ABCA1依賴性巨噬細胞脂質(zhì)外流增加AS斑塊的穩(wěn)定性[32]，但目前尚無關(guān)于EXO內(nèi)CXCL-12的相關(guān)研究。BIRC5是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的成員，LI等[33]通過對小鼠頸動脈單細胞測序發(fā)現(xiàn)BIRC5可能與血流紊亂所致血管巨噬細胞聚集相關(guān)。早在2002年便有報道指出BPI的單核苷酸多態(tài)性同心肌梗死密切相關(guān)[34]，BLEIJERVELD等[35]通過循環(huán)中粒細胞的深度蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)了BPI可以作為嚴重AS性冠狀動脈狹窄的生物標志物，這表明BPI可以作為晚期CAD乃至預測急性心血管事件的標志物。F2R是血管壁炎癥和血栓形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其多態(tài)性同氯吡格雷療效密切相關(guān)[36]，但目前少有F2R在AS中的研究。

綜上所述，本研究共確定了DDX47、FEM1C、NOL11、SRP54、ABI1、PATL1、BNIP2、C1orf159、CHCHD4、RPS27A共10個關(guān)鍵基因，RNASE1、BPI、BIRC5、CXCL12、F2R共5個可能源自EAT EXO的基因進行了驗證，證明其在CAD中的診療意義，此外還探討了CAD患者EAT免疫浸潤情況，為CAD的基礎(chǔ)研究提供理論支持。本研究有其局限性，本研究主要針對mRNA，但蛋白質(zhì)才是生命活動的執(zhí)行者，mRNA層面的改變并不能等同蛋白質(zhì)層面的改變，因此本研究所得結(jié)論仍需動物、細胞實驗進一步驗證。

本文無利益沖突。

參考文獻略