 一種谷氨酸脫羧酶突變體及其在生產(chǎn) γ-氨基丁酸中的應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明公開了一種活性增強(qiáng)的谷氨酸脫羧酶突變體及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。 背景技術(shù)： [0002] γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyricacid, gaba)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降低血壓、抗焦慮和抑郁、改善睡眠、提高記憶力、治療癲癇等生理功能，在食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域具有廣泛的市場前景。γ-氨基丁酸因較好的生理功能和應(yīng)用前景受到廣泛關(guān)注，并被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品中。日本厚生省、歐洲食品安全局和美國食品藥品管理局承認(rèn)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的gaba為天然食品添加劑。我國衛(wèi)生部也批準(zhǔn)此類產(chǎn)品為新資源食品。此外，γ-氨基丁酸還可用于合成2-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮可用于合成尼龍-4，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，目前全球各類 gaba 總產(chǎn)能約6萬噸/年，約10 %屬于微生物法或植物富集法生產(chǎn)的可以應(yīng)用于食品或醫(yī)藥等領(lǐng)域。 [0003] 目前，γ-氨基丁酸生產(chǎn)包括化學(xué)合成法、植物富集法和微生物合成法等。化學(xué)合成的gaba有原料殘留，因此安全性差，不能添加到食品中；植物中g(shù)aba含量低，富集提取成本較高；而微生物合成gaba因安全性高、生產(chǎn)成本低和對環(huán)境友好更具開發(fā)價(jià)值。谷氨酸脫羧酶（ec 4.1.1.15）能不可逆地催化l-谷氨酸（鹽）轉(zhuǎn)化生成γ-氨基丁酸，是生物轉(zhuǎn)化法合成γ-氨基丁酸的關(guān)鍵酶制劑，具有巨大的市場應(yīng)用價(jià)值。但是，目前國內(nèi)外已報(bào)道的谷氨酸脫羧酶一般催化效率較低且酶活性范圍偏酸性，這一特性已經(jīng)嚴(yán)重影響了其在工業(yè)上的應(yīng)用前景。 [0004] 因此，通過篩選或分子改造谷氨酸脫羧酶，獲得具有優(yōu)良的催化性能的關(guān)鍵酶制劑，并基于此構(gòu)建高效生物催化系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)γ-氨基丁酸高產(chǎn)需要解決的主要技術(shù)問題之一。 技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素： [0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種催化性能提升的谷氨酸脫羧酶突變體及其重組菌株，并使用該菌株建立了高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法。 [0006] 本發(fā)明首先提供了一種酶活提高的谷氨酸脫羧酶突變體，是將對應(yīng)于來源自巨大芽孢桿菌cicc 10055的野生型谷氨酸脫羧酶seq id no:1第280位氨基酸由酪氨酸y突變?yōu)榧琢虬彼醡的氨基酸序列。所述谷氨酸脫羧酶突變體包括如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脫羧酶突變體的編碼核苷酸序列可以是seq id no:4所示的核苷酸序列。 [0007] 其次，本發(fā)明提供表達(dá)了一種生產(chǎn)γ-氨基丁酸的雙酶共表達(dá)載體，所述共表達(dá)載體是在一個(gè)質(zhì)粒中同時(shí)導(dǎo)入谷氨酸脫羧酶突變體和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種重組菌株，其是將所述雙酶共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或?qū)胨拗骶晁?。宿主菌株選自棒桿菌屬、腸桿菌屬或短桿菌屬菌株，優(yōu)選地是谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌枯草芽孢桿菌等。 id no:1的氨基酸序列的第280位酪氨酸y為突變靶點(diǎn)。 [0016] 采用定點(diǎn)突變策略，根據(jù)待突變的氨基酸位點(diǎn)來設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，通過pcr方法獲得谷氨酸脫羧酶突變序列。 [0017] 本實(shí)施例選取的表達(dá)載體pxmj19為誘導(dǎo)表達(dá)型載體，該質(zhì)粒本身含有強(qiáng)啟動(dòng)子tac相關(guān)序列（包括操縱序列l(wèi)aco），當(dāng)加入iptg或乳糖等誘導(dǎo)物時(shí)，會促使阻遏蛋白離開操縱序列從而起始基因表達(dá)。設(shè)計(jì)包含突變位點(diǎn)的重疊互補(bǔ)引物（y280m-f：5 ’- aggacacaagtatggtttagtttaccctggcttg-3 ’ 和y280m-r：5 ’- ctaaaccatacttgtgtcctgacacgttaatg-3 ’ ），以含有野生型谷氨酸脫羧酶編碼序列的pxmj19-gad質(zhì)粒為模板，利用pcr擴(kuò)增獲得相應(yīng)點(diǎn)突變質(zhì)粒后，使用dpni限制性內(nèi)切酶消化模板質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并涂布含有氯霉素的篩選平板。篩選獲得含有特定突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒突變體，并進(jìn)行公司測序確認(rèn)，突變質(zhì)粒分別命名為pxmj19-gad-y280m。 [0018] 實(shí)施例2 谷氨酸脫羧酶突變體酶活測定將上述獲得的含有pxmj19-gad-y280m質(zhì)粒的重組大腸桿菌進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。具體方法為：將單克隆菌落接種于含有3 ml lb液體培養(yǎng)基(10 g/l胰蛋白胨，5 g/l酵母提取物，5 g/l nacl)，經(jīng)過過夜培養(yǎng)后獲得種子液。將種子液以1%體積比轉(zhuǎn)接于100 ml lb液體培養(yǎng)基中，菌體濃度od600生長至1.0左右時(shí)，添加終濃度為0.4 mm iptg誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，調(diào)整培養(yǎng)溫度25℃，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。 [0019] 離心收集菌體后，棄上清，用ddh 2 o重懸菌體細(xì)胞。采用超聲破碎法對菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。谷氨酸脫羧酶活性測定采用以下標(biāo)準(zhǔn)方案：取0.4 ml樣品溶液，依次加入 0.1 ml 1mol/l 碳酸鈉溶液，0.5 ml 0.2mol/l硼酸鹽緩沖液（ph 10），上下?lián)u動(dòng)混勻后，加入1 ml 6%苯酚溶液，加入1 ml 次氯酸鈉溶液（有效氯不低于7.5%），搖勻后室溫放置6 min，沸水浴中加熱10 min，立即置于冰浴中10 min，然后加入2 ml 60%乙醇，混勻后室溫放置10 min，測定640 nm處吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)過比色法，測定od640吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，gaba濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活定義：每分鐘生成1 μmol gaba定義為一個(gè)酶活單位u，每毫克蛋白對應(yīng)的酶活為比酶活u/mg。 [0020] 通過谷氨酸脫羧酶的活性測定分析，發(fā)現(xiàn)相較于野生型谷氨酸脫羧酶，谷氨酸脫羧酶突變體y280m在不同ph或溫度條件下都表現(xiàn)出明顯提高的酶活性，提示其更適合工業(yè)化生產(chǎn)。 [0021] 表1 野生型和突變體的催化活性比較實(shí)施例3 谷氨酸脫羧酶和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共表達(dá)重組菌株構(gòu)建采用單個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子將谷氨酸脫羧酶突變體編碼基因和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，其中谷氨酸脫羧酶突變體編碼基因和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因間為保守性rbs序列（5 ’- ctttaagaaggagatatacat-3 ’ ）。在具體實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)一對引物對（gad-5f：5 ’- agtcggatccatgcctcaatggcatccgcatc-3 ’ 和gad-3r：5 ’- ctgtctgtactgatgtagccatatgtatatctccttcttaaagttaatgatgaaatccat-3），以pxmj19-gad-y280m突變質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得y280m突變體片段；設(shè)計(jì)一對引物對（gadt-5f：5 ’-? gacaatggatttcatcattaactttaagaaggagatatacatatggctacatcagtacagacag-3 ’ 和gadt-3r：5 ’- tgctgaattcttagtgtttcttgtcattcatcacaatatatgctggtgaagttgcacg-3 ’ ），以大腸桿菌基因組為模板，擴(kuò)增獲得gadt片段。以上述兩段基因序列為模板，并以gad-5f和gadt-3r為引物，通過搭橋pcr擴(kuò)增獲得已經(jīng)添加rbs序列的谷氨谷氨酸脫羧酶突變體和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因融合片段（y280m-gadt）。將上述片段經(jīng)過bamhi和ecori雙酶切后進(jìn)行回收，與同樣經(jīng)過bamhi和ecori雙酶切的pxmj19質(zhì)粒骨架進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選獲得雙酶共表達(dá)載體pxmj19-y280m-gadt，將所獲質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序確認(rèn)。將上述構(gòu)建獲得的雙酶共表達(dá)載體pxmj19-y280m-gadt，轉(zhuǎn)化食品安全級工業(yè)菌種谷氨酸棒桿菌，篩選獲得含有雙酶共表達(dá)載體的重組菌株，用于γ-氨基丁酸的生產(chǎn)制備。 [0022] 實(shí)施例4 重組菌株的高密度發(fā)酵培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)本實(shí)施例用于提供一種重組菌株的高密度發(fā)酵培養(yǎng)和全細(xì)胞催化菌泥的制備方法。所述發(fā)酵培養(yǎng)的方法可以包括以下步驟：將含有雙酶共表達(dá)載體pxmj19-y280m-gadt的重組菌株，接種于100 ml lbhis液體培養(yǎng)基（2.5 g/l酵母提取，5 g/l胰蛋白胨，5 g/l nacl，18 g/l 腦心浸液），在32 ?° c，200 r/min搖床中進(jìn)行過夜震蕩培養(yǎng)，獲得重組菌株種子液。按照2~4%接種量將種子液接種于已裝有5 l發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，設(shè)定培養(yǎng)溫度30 ° c，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，自動(dòng)控制培養(yǎng)ph條件為7.0。待菌體生長至od 600 ≈30~50時(shí)，添加終濃度為1 mm iptg，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)20 h，誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)。待誘導(dǎo)完成后，取1 ml菌液進(jìn)行超聲破碎處理后，隨后利用sds-page檢測重組菌株中雙酶的表達(dá)情況。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體細(xì)胞，去掉上清廢液，使用ddh 2 o洗滌和重懸菌體細(xì)胞，即得全細(xì)胞催化用菌泥。 [0023] 實(shí)施例5 構(gòu)建全細(xì)胞催化系統(tǒng)高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸基于全細(xì)胞催化生產(chǎn)γ-氨基丁酸示意圖見圖2。將構(gòu)建的表達(dá)谷氨酸脫羧酶突變體和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重組菌株，在純水相體系中直接加入l-谷氨酸底物，開發(fā)生物轉(zhuǎn)化法高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的工藝。作為一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案，利用3 l發(fā)酵罐建立全細(xì)胞催化反應(yīng)體系，分批次添加950 g/l終濃度的l-谷氨酸底物，加入15 g/l全細(xì)胞催化用菌泥，控制反應(yīng)轉(zhuǎn)速200 r/min，催化反應(yīng)溫度35 ° c，催化反應(yīng)時(shí)間12 h。待反應(yīng)結(jié)束后，利用液相色譜法對全細(xì)胞催化反應(yīng)液組分和含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，基于共表達(dá)谷氨酸脫羧酶突變體和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建的重組菌株具有優(yōu)良的γ-氨基丁酸生產(chǎn)能力，全細(xì)胞催化反應(yīng)12 h后，轉(zhuǎn)化液中γ-氨基丁酸的含量可達(dá)662.1 g/l，底物摩爾轉(zhuǎn)化率接近100%。相比于含有未突變谷氨酸脫羧酶基因的重組菌，本發(fā)明的谷氨酸脫羧酶基因突變體的重組菌的轉(zhuǎn)化率提高顯著，因而具有更好的工業(yè)化應(yīng)用前景。 [0024] 表2 野生型和突變體菌株的γ-氨基丁酸生產(chǎn)性能 通過離心收集全細(xì)胞催化結(jié)束后的轉(zhuǎn)化液，去陳菌體沉淀細(xì)胞，建立和優(yōu)化γ-氨基丁酸分離提取工藝。γ-氨基丁酸分離純化的工藝基本流程包括轉(zhuǎn)化液預(yù)處理、雙層濾紙過濾、活性炭脫色、真空抽濾、冷卻結(jié)晶、洗滌干燥等。經(jīng)過上述工藝獲得的γ-氨基丁酸樣品具有優(yōu)良的晶型、色澤和純度（獲得的γ-氨基丁酸產(chǎn)品如圖3所示）。 [0025] 以上，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實(shí)施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 |
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