補充因疾病而失去的細胞是再生醫(yī)學領域的“圣杯”，然而，成年哺乳動物（包括人類）的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）在很大程度上已經(jīng)失去了這種再生能力。近年來，有一種新興策略通過將體內(nèi)的膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，這為治療神經(jīng)退行性疾病帶來了巨大希望。但想實現(xiàn)這一點，不但復雜而且效率低下。

2020年，兩篇分別發(fā)表于 Cell 和 Nature 的頂刊論文顯示， 只需敲低Ptbp1，就能高效誘導膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化，挽救帕金森病小鼠模型的運動障礙。這為通過膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化來治療神經(jīng)退行性疾病帶來了巨大前景。然而，其他團隊并沒有能夠重復出這兩篇論文的結果，人們開始質(zhì)疑，敲低Ptbp1后，膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化真的發(fā)生了嗎？

2020年4月，中科院神經(jīng)所楊輝團隊在 Cell 期刊發(fā)表了題為：Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice 的論文【1】。該研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR-CasRx系統(tǒng)敲低Ptbp1，能夠誘導膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

2020年6月，加州大學圣地亞哥分校付向東團隊在 Nature 發(fā)表了題為：Reversing a model of Parkinson's disease with in situconverted nigral neurons 的論文【2】。該研究發(fā)現(xiàn)，使用shRNA或反義寡核苷酸（ASO）敲低Ptbp1蛋白表達，能夠誘導膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

這兩項研究提示了我們，Ptbp1基因可能是治療包括帕金森病在內(nèi)的因神經(jīng)元損傷導致的神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點。

這兩篇論文發(fā)表后，在業(yè)內(nèi)引起廣泛關注和爭議。

2021年9月，德州大學西南醫(yī)學中心張春立團隊在 Cell 發(fā)表了題為：Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo 的論文【3】。該研究利用譜系追蹤證明，無論是過表達NeuroD1，還是敲低Ptbp1，都不能在體內(nèi)將膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，之前的研究中觀察到的轉(zhuǎn)分化而來的神經(jīng)元實際上是大腦中原本就存在的內(nèi)源性神經(jīng)元。

2021年10月，約翰·霍普金斯大學醫(yī)學院 Seth Blackshaw 團隊在預印本 bioRxiv 發(fā)表了題為：Ptbp1 deletion does not induce glia-to-neuron conversion in adult mouse retina and brain 的論文【4】。該論文指出，在小鼠的視網(wǎng)膜和大腦中，Ptbp1的特異性缺失，都不會誘導膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。2022年6月，Seth Blackshaw 團隊將部分試驗結果發(fā)表在了 Cell Reports 期刊【5】。

值得一提的是，2023年2月，楊輝團隊在 Gene Therapy 期刊發(fā)表了題為：Ptbp1 knockdown failed to induce astrocytes to neurons in vivo 的論文【6】。該研究指出，Cas13x介導的Ptbp1的敲低在體內(nèi)不能誘導膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。從而否定了此前在 Cell 發(fā)表的結果，認為之前的結果是由于GFAP-AAV泄漏所致。

2023年6月7日，約翰·霍普金斯大學醫(yī)學院 Seth Blackshaw 團隊在 Nature 發(fā)表了題為：Ptbp1 deletion does not induce astrocyte-toneuron conversion 的文章【7】。

這項研究顯示，Ptbp1功能缺失并不會誘導星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的分化，甚至并沒有引起星型膠質(zhì)細胞基因表達的實質(zhì)性改變。

Seth Blackshaw 團隊指出，付向東團隊的這篇 Nature 論文中觀察到的Ptbp1敲低所誘導的膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)分化的結論缺乏一些必要的直接證據(jù)。通過對攜帶Ptbp1雜合或純合突變的成熟星形膠質(zhì)細胞的遺傳譜系和單細胞RNA測序（scRNA-Seq）分析顯示，Ptbp1缺失的星形膠質(zhì)細胞并沒有向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，也沒有對其他基因表達產(chǎn)生實質(zhì)性影響。

為了從基因上破壞星形膠質(zhì)細胞中Ptbp1的功能，研究團隊使用了星形膠質(zhì)細胞特異性他莫昔芬誘導的Aldh1l1creERT2小鼠以及Sun1-GFPloxP/loxP和Ptbp1loxP/loxP細胞系，并使用4-羥基他莫昔芬（4-OHT）誘導星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生雜合性或純合型Ptbp1缺失，這些星形膠質(zhì)細胞被SUN1-GFP不可逆標記用于譜系追蹤。在4-OHT誘導后第2、4、8周，在任何基因型小鼠中都沒有觀察到大腦中新型膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。

付向東團隊的 Nature 論文顯示，敲低Ptbp1誘導的膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化而來的神經(jīng)元可以分泌多巴胺，恢復6-羥多巴胺（6-OHDA）損傷多巴胺能神經(jīng)元誘導的帕金森病小鼠模型的運動功能。

然而，這篇發(fā)表在 Nature 的質(zhì)疑文章顯示，6-OHDA損傷的Ptbp1雜合缺失或純合缺失的小鼠都沒有出現(xiàn)新生的神經(jīng)元。因此，研究團隊得出結論：無論是否有神經(jīng)元損傷，Ptbp1功能缺失都不會導致星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。

接下來，研究團隊檢查了Ptbp1缺失是否改變了星形膠質(zhì)細胞的生理活動。膜片鉗實驗顯示，Ptbp1雜合缺失或純合缺失都不會誘導星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)神經(jīng)元樣電生理特性。

為了全面分析Ptbp1缺失在新型膠質(zhì)細胞中的分子效應，研究團隊對4-OHT誘導2周后的野生型、雜合型和純合型Ptbp1缺失小鼠的整個皮質(zhì)、紋狀體和黑質(zhì)進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析。結果顯示，Ptbp1缺失后，大多數(shù)星形膠質(zhì)細胞標志物的表達沒有變化，且未觀察到神經(jīng)祖細胞或成熟神經(jīng)元特異性基因的誘導。免疫染色實驗證實Ptbp1缺失的星形膠質(zhì)細胞保留了膠質(zhì)細胞標志物SOX9的表達。研究團隊得出結論：Ptbp1不會抑制星形膠質(zhì)細胞中神經(jīng)元基因的表達。

為了進一步研究Ptbp1功能缺失在稍后時間點誘導的基因表達變化，我們研究團隊在4- OHT誘導野生型和純合Ptbp1缺失小鼠4周后，對GFP陽性星形膠質(zhì)細胞和熒光活化細胞分選富集的星形膠質(zhì)細胞來源的細胞進行了進一步的scRNA-seq分析。結果顯示，在Ptbp1缺失后，所有三個腦區(qū)中神經(jīng)源性或其他細胞類型特異性標志基因的表達沒有差異。大多數(shù)星形膠質(zhì)細胞標志物的表達未發(fā)生變化，未觀察到神經(jīng)祖細胞或成熟神經(jīng)元特異性基因的誘導。這些結果表明，Ptbp1缺失后的星形膠質(zhì)細胞，沒有出現(xiàn)膠質(zhì)細胞特異性基因的表達，也沒有星形膠質(zhì)細胞特異性基因的表達下調(diào)。

總的來說，該研究實現(xiàn)了對Ptbp1的高效和細胞特異性敲除，但無論是Ptbp1雜合缺失還是純合缺失小鼠中，都沒有觀察到星型膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析顯示，雜合和純合Ptbp1缺失的星形膠質(zhì)細胞的基因表達有細微變化，但并未誘導神經(jīng)元特異性基因表達或神經(jīng)元樣電生理特性。

結合最近發(fā)表的一系列論文均未能重復出敲低Ptbp1實現(xiàn)膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的結果，以及楊輝團隊對自己此前 Cell 論文結果的否定，研究團隊表示，此前的敲低Ptbp1后膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化的結果不太可能是Ptbp1功能缺失引起的。這也突出了在細胞類型轉(zhuǎn)化的研究中使用遺傳操作、譜系追蹤和基因表達分析的重要性。

從論文的投稿記錄來看，這篇論文于2021年9月就已投稿到 Nature，此后補充了大量實驗和數(shù)據(jù)，從而更加嚴謹?shù)卣撌隽薖tbp1功能缺失不能誘導膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的觀點。

而最早通過論文質(zhì)疑Ptbp1作用的張春立教授直言不諱地表示：抑制Ptbp1就算有治療潛力，那也不是源于膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。

張春立教授在 Annual Review of Neuroscience 期刊發(fā)表了題為：Therapeutic Potential of PTBP1 Inhibition, If Any, Is Not Attributed to Glia-to-Neuron Conversion 的綜述論文【7】。

張春立教授在這篇綜述中回顧了基于Ptbp1的膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的研究爭議，總結了對體內(nèi)膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化和Ptbp1未來研究的建議。

對于 Seth Blackshaw 團隊在 Nature 發(fā)表的質(zhì)疑文章，付向東團隊同期在 Nature 發(fā)布了回應【8】。

付向東團隊表示，在分析了 Seth Blackshaw 團隊發(fā)布的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)后，得出了相反的結論。此外，之前在許多生物系統(tǒng)中的研究顯示，敲除基因與敲低基因會產(chǎn)生不同的表型，因此，Ptbp1的敲除和敲低葉可能產(chǎn)生不同的表型。

雖然尚不能排除觀察到的星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化可能是由于現(xiàn)有神經(jīng)元泄漏造成的，但目前的scRNA-seq和免疫染色數(shù)據(jù)表明，存在一種星形膠質(zhì)細胞或星形細胞樣細胞亞類，其比成熟星形膠質(zhì)細胞更傾向于重定向到神經(jīng)元譜系，這一可能性有待于未來的研究。