崔佳佳，張雪洪

上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院

摘要：開(kāi)發(fā)高效、低毒、低殘留的綠色農(nóng)藥是農(nóng)藥研發(fā)的發(fā)展趨勢(shì)，其中微生物源農(nóng)藥抗生素占據(jù)了重要地位。隨著基因組學(xué)、代謝工程和高通量篩選等技術(shù)的發(fā)展，新型微生物源農(nóng)用抗生素的研究進(jìn)入了新的階段。文中簡(jiǎn)要總結(jié)了近10年來(lái)研發(fā)的新型微生物源農(nóng)用抗生素的種類、農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌株的高產(chǎn)育種與發(fā)酵研究策略等，為未來(lái)農(nóng)用抗生素的研發(fā)提供參考。

近年來(lái)隨著生態(tài)保護(hù)、食品安全、綠色生產(chǎn)、可持續(xù)發(fā)展等理念的深入人心，化學(xué)農(nóng)藥的監(jiān)管也越來(lái)越嚴(yán)格。開(kāi)發(fā)高效、低毒、低殘留、無(wú)污染的生物農(nóng)藥成為未來(lái)農(nóng)藥研發(fā)的發(fā)展方向。微生物源農(nóng)用抗生素在生物農(nóng)藥中占據(jù)重要地位，它們是由微生物合成的具有生物可降解性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因其高效、安全、環(huán)境友好的特性成為了化學(xué)農(nóng)藥的綠色替代品，是植物病蟲(chóng)害防治和綠色可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前微生物源農(nóng)用抗生素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和植物病害的防治，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出了重要貢獻(xiàn)。隨著微生物育種技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)的提升，各種農(nóng)用抗生素的發(fā)酵效價(jià)不斷提高、發(fā)酵規(guī)模不斷擴(kuò)大、生產(chǎn)成本逐步降低，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的競(jìng)爭(zhēng)力日益增強(qiáng)，如井岡霉素、阿維菌素、中生菌素、南昌霉素、春雷霉素、瀏陽(yáng)霉素、多抗霉素、申嗪霉素、武夷霉素、寧南霉素、多殺菌素、滅瘟素等。

同時(shí)，通過(guò)篩選活性先導(dǎo)化合物，采用組合技術(shù)和基因工程方法，對(duì)基因簇及代謝途徑進(jìn)行修飾和改造、研究新型的抗生素和提高有效組分的產(chǎn)量；在微生物全基因組測(cè)序和功能基因研究的基礎(chǔ)上，克隆和發(fā)掘新的具有殺蟲(chóng)和殺菌功能的基因，研究基因的高效表達(dá)和調(diào)控；建立生物農(nóng)藥大規(guī)模、高通量篩選技術(shù)平臺(tái)，篩選新型農(nóng)用抗生素；基于高通量篩選技術(shù)利用體外分子誘變進(jìn)化技術(shù)、基因隨機(jī)誘變或重組等，篩選和改造農(nóng)用抗生素高產(chǎn)菌株；利用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)、生化工程技術(shù)以及工程化系統(tǒng)集成加快發(fā)酵工藝優(yōu)化改進(jìn)，大幅度提高農(nóng)用抗生素發(fā)酵技術(shù)水平。新的農(nóng)用抗生素得到持續(xù)研發(fā)、傳統(tǒng)農(nóng)用抗生素的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)一步穩(wěn)定、生產(chǎn)效率大大提高。本文簡(jiǎn)要總結(jié)了近10年來(lái)研發(fā)的新型微生物源農(nóng)用抗生素的種類，農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌株的高產(chǎn)育種研究策略等，為未來(lái)農(nóng)用抗生素的研發(fā)提供參考。

微生物源農(nóng)用抗生素因高效、綠色環(huán)保等特性而成為生物農(nóng)藥的主力品種，積極篩選和開(kāi)發(fā)新型微生物源農(nóng)用抗生素對(duì)于推動(dòng)生物農(nóng)藥的發(fā)展、促進(jìn)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。本文簡(jiǎn)要總結(jié)了近10年來(lái)研發(fā)的新型微生物源農(nóng)用抗生素 (表1)。

吩嗪類抗生素是一類具有含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，假單胞菌屬和鏈霉菌屬是天然吩嗪類抗生素的主要生產(chǎn)者，吩嗪類抗生素因其廣譜抑菌活性受到研究人員的廣泛關(guān)注^[11]。目前作為農(nóng)用抗生素研究的主要有吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-甲酰胺、2-羥基吩嗪等。

1.1.1  吩嗪-1-羧酸 (Phenazine-1-carboxylic acid，PCA)

PCA是一種黃色的吩嗪類化合物，在2011年由銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa M18產(chǎn)生的PCA被中國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為一種新型微生物源殺菌劑“申嗪霉素”，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。PCA對(duì)于水稻紋枯病、西瓜枯萎病、甜椒疫病、辣椒疫病以及黃瓜枯萎病等具有良好的防治效果，但是PCA的抗真菌活性受環(huán)境pH的影響較大^[12]。

1.1.2  吩嗪-1-甲酰胺 (Phenazine-1-carboxamide，PCN)

PCN可由綠針假單胞菌P. chlororaphis和   P. aeruginosa等合成，PCN對(duì)于尖孢鐮刀菌、水稻黃單胞菌、立枯絲核菌^[13]、番茄鐮刀菌以及終極腐霉等多種植物病原真菌具有顯著的拮抗作用。在中性條件下，PCN的抗真菌活性比PCA高得多，因此PCN能夠適應(yīng)不斷變化的環(huán)境^[14-15]。

1.1.3  2-羥基吩嗪 (2-hydroxyphenazines，2-OH-PHZ)

2-OH-PHZ是由P. chlororaphis 30–84和    P. chlororaphis GP72等綠針假單胞菌產(chǎn)生的一種吩嗪衍生物，2-OH-PHZ具有廣譜殺菌性，能夠有效防治小麥全蝕病，對(duì)于疫霉、腐霉等植物病原真菌也具有很好的抑制作用^[16]。

1.2.1  疏螺體素 (Borrelidin)

疏螺體素為淺黃色晶體，是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，分離自鏈霉菌屬。疏螺體素對(duì)于大豆疫霉菌、瓜果腐霉、終極腐霉以及辣椒疫霉等植物病原真菌具有顯著的拮抗作用，其中疏螺體素對(duì)大豆疫霉菌具有很高的特異性抗真菌活性，10 mg/L的疏螺體素對(duì)大豆疫霉菌的防治效果達(dá)到了94.72%，其防治效果顯著高于甲霜靈^[3]。

1.2.2  米爾貝霉素 (Milbemycins)

米爾貝霉素是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有強(qiáng)效的抗蟲(chóng)和殺蟲(chóng)活性。由冰城鏈霉菌Streptomyces bingchenggensis產(chǎn)生的米爾貝霉素A3/A4已被開(kāi)發(fā)為防治農(nóng)業(yè)螨蟲(chóng)的殺螨劑，米爾貝霉素A3/A4的半合成衍生物米爾比霉素肟化物已經(jīng)用于線蟲(chóng)、絲蟲(chóng)等害蟲(chóng)的防治，其他米爾貝霉素A3/A4的衍生物如雷皮菌素和拉替菌素也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域^[17]。

1.2.3  藤黃綠膿菌素 (Pyoluteorin，Plt)

Plt是一種最早從P. aeruginosa中分離出來(lái)的聚酮合酶 (Polyketide synthase，PKS)/非核糖體肽合酶 (Non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)雜合抗生素，對(duì)于真菌 (特別是腐霉屬) 和細(xì)菌具有廣譜抗菌活性，可通過(guò)采用薄層色譜法以及飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)藤黃綠膿菌素進(jìn)行相應(yīng)的鑒定^[18-19]。

1.2.4  茴香霉素 (Anisomycin)

茴香霉素是由玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌 S. roseochromogenes、刺孢吸水鏈霉菌北京變種   S. hygrospinosus var. beijingensis、淺灰色鏈霉菌 S. griseolus等產(chǎn)生的一種吡咯烷類抗生素，是農(nóng)抗120中重要的有效成分之一，對(duì)其生物合成基因簇進(jìn)行鑒定后通過(guò)發(fā)酵分離得到。茴香霉素主要用于農(nóng)作物真菌病害的防治，比如農(nóng)作物白粉病、西瓜腐爛病、水稻紋枯病等^[6,20]。

1.2.5  Xenocoumacin 1 (Xcn1)

Xenocoumacin 1 (Xcn1) 是從嗜線蟲(chóng)致病桿菌Xenorhabdus nematophila的培養(yǎng)物中分離出的主要抗菌化合物，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌表現(xiàn)出廣泛的抗菌活性，并且對(duì)于互隔交鏈孢霉、灰霉菌、立枯絲核菌、疫霉菌等具有很強(qiáng)的抑制活性，具有成為新型生物農(nóng)藥的巨大潛力^[21-22]。

1.3.1  桿菌霉素D (Bacillomycin D)

桿菌霉素D是由解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌B. subtitles、貝萊斯芽孢桿菌B. velezensis等產(chǎn)生的一種環(huán)狀抗真菌脂肽。桿菌霉素D可以有效抑制孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)^[23]，對(duì)于黃曲霉、禾谷鐮刀菌、炭疽菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉等具有很強(qiáng)的抑制活性^[24-25]。桿菌霉素D安全且易于降解，土壤中的桿菌霉素D通過(guò)分解為氨基酸殘基，可以防止其積累達(dá)到有害水平^[26]。

1.3.2  恩拉霉素 (Enduracidins)

恩拉霉素最初是從殺真菌素鏈霉菌 S. fungicidicus中分離出來(lái)的一組脂肽抗生素，可以甲醇為溶劑并利用超聲輔助進(jìn)行分離提取^[27]。恩拉霉素由17個(gè)氨基酸組成，根據(jù)脂肪鏈長(zhǎng)度的不同分為恩拉霉素A和恩拉霉素B。恩拉霉素是  一種堿性抗生素，由于對(duì)于大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌具有很好的抑制活性^[10,27-28]，因此有望在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用。

新奧霉素是由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所用遺傳改良菌株“諾爾斯鏈霉菌Xi Ao-3”發(fā)酵生產(chǎn)的一種新型尿嘧啶核苷肽類抗生素，對(duì)疫霉菌、炭疽病菌、棉花黃萎病菌、番茄花葉病毒以及西瓜花葉病毒具有很強(qiáng)的抑制活性^[29-30]。新奧霉素作為一種新型廣譜生物殺菌劑存在一定的缺陷，一是新奧霉素產(chǎn)品呈酸性，不適宜與堿性藥劑混合使用；二是新奧霉素對(duì)紫外光線敏感，不宜在強(qiáng)日照下使用^[8]。

不同用途的微生物源抗生素的高產(chǎn)育種方法基本相似，相關(guān)方法同樣應(yīng)用于農(nóng)用抗生素的研發(fā)。從自然界分離出來(lái)的野生型菌株所產(chǎn)生的抗生素含量一般很低，無(wú)法滿足商業(yè)需求。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌株選育的常用手段是采用化學(xué)或物理誘變、基因工程育種等。傳統(tǒng)的化學(xué)誘變、UV誘變、放射誘變等仍是生物企業(yè)常用的育種手段，近年來(lái)常壓室溫等離子體 (Atmospheric and room temperature plasma，ARTP) 因安全、簡(jiǎn)便得到廣泛應(yīng)用。隨著微生物基因組學(xué)的發(fā)展，代謝工程技術(shù)及基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，基因工程育種已成為抗生素高產(chǎn)菌株獲得的主要途徑。

近年來(lái)，ARTP技術(shù)和重離子誘變技術(shù)被認(rèn)為是有效和新穎的微生物誘變育種技術(shù)。ARTP的核心組件是RF ARGD等離子體發(fā)生器，它產(chǎn)生的等離子體射流可以改變細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和通透性，導(dǎo)致DNA損傷，包括錯(cuò)義突變、核苷酸缺失或核苷酸移碼突變等，與傳統(tǒng)誘變育種方法相比，ARTP具有突變速度快，操作靈活度高、安全高效等特點(diǎn)^[30-31]。目前，ARTP技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于假單胞菌屬和鏈霉菌屬等高產(chǎn)菌株的選育，使得吩嗪-1-甲酰胺、阿維菌素和米爾貝霉素A3/A4的產(chǎn)量有了較大的提升^[32-34]。

重離子誘變技術(shù)也是一種產(chǎn)生微生物突變體的有效方法，相比傳統(tǒng)的誘變方法它可以產(chǎn)生更高的突變率和突變譜。重離子誘變通過(guò)熱和電離效應(yīng)等直接造成微生物菌株的DNA損傷，這些DNA損傷更加有利于微生物突變體的產(chǎn)生。如通過(guò)利用蘭州重離子加速器 (Heavy ion research facility in Lanzhou，HIRFL) 對(duì)鏈霉菌進(jìn)行誘變育種，提高了恩拉霉素以及阿維菌素的產(chǎn)量^[35]。

微生物進(jìn)行誘變育種后需要對(duì)大量的菌株進(jìn)行測(cè)試與篩選，傳統(tǒng)的瓊脂平板初步篩選、搖瓶發(fā)酵二次篩選和高效液相色譜 (High performance liquid chromatography，HPLC) 驗(yàn)證產(chǎn)量的篩選過(guò)程非常耗時(shí)，因此在育種過(guò)程中需要建立簡(jiǎn)單快速的高通量篩選方法以有效率地獲得陽(yáng)性菌株。在P. chlororaphis GP72中將2-OH-PHZ合成途徑中的限制性酶PhzO替換為綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP)，以GFP作為篩選標(biāo)記進(jìn)行誘變育種，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度進(jìn)行高通量篩選，在篩選出的突變株中通過(guò)PhzO的回替，使2-OH-PHZ的產(chǎn)量比野生型菌株提高了4.62倍^[36]；在對(duì)S. lomondensis S015進(jìn)行ARTP技術(shù)和紫外復(fù)合誘變育種后，建立了基于24孔深孔板發(fā)酵和酶標(biāo)儀快速檢測(cè)的高通量篩選方法^[37]。

新型誘變育種操作簡(jiǎn)單、突變率高，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)良的突變類型，但是誘變育種具有 一定的盲目性與隨機(jī)性，一般情況下產(chǎn)生的有益突變體頻率低，而且后期突變菌株的篩選比較困難。

2.2.1  利用代謝工程技術(shù)改造生產(chǎn)菌株

負(fù)調(diào)控基因的敲除、正調(diào)控基因的過(guò)表達(dá)、分支途徑的改造是基因工程育種的常用方法。微生物代謝網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，基因組學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展和基因編輯技術(shù)的建立為微生物源農(nóng)用抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了新的發(fā)展空間。通過(guò)系統(tǒng)性篩選和代謝網(wǎng)絡(luò)分析，抑制負(fù)調(diào)控途徑或因子、擴(kuò)增正調(diào)控途徑或因子、加強(qiáng)產(chǎn)物運(yùn)輸系統(tǒng)、增強(qiáng)前體途徑、操縱產(chǎn)物反饋機(jī)制以及消除競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑等方法可以使微生物源農(nóng)用抗生素的產(chǎn)量有較大的提升^[19,38]。

在P. chlororaphis GP72中敲除4個(gè)負(fù)調(diào)控基因pykF、rpeA、rsmE和lon，過(guò)表達(dá)6個(gè)基因ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE (提高莽草酸途徑) 后使得2-OH-PHZ的產(chǎn)量由4.5 mg/L提高到450.4 mg/L，比原始菌株提高了99倍^[16]；通過(guò)在P. chlororaphis HT66中敲除3個(gè)負(fù)調(diào)控基因lon、parS和prsA，成功構(gòu)建了高產(chǎn)菌株HT66LSP，高產(chǎn)菌的PCN產(chǎn)量達(dá)到了4.10 g/L，比野生菌株提高了8.6倍^[39]；在S. bingchenggensis中，通過(guò)敲除cyp41基因和過(guò)表達(dá)milE基因使得米爾貝霉素A3/A4的產(chǎn)量提高了53.1%^[40]。在P. aeruginosa PA12O1中通過(guò)對(duì)毒力因子、PCA生物合成途徑、PCA流出泵系統(tǒng)以及次級(jí)代謝途徑進(jìn)行組合基因工程，獲得了一株遺傳穩(wěn)定、低毒性的高產(chǎn)菌株PA-Ⅳ，其PCA產(chǎn)量為9 882 mg/L，與原始菌株相比提高了54倍^[41]。

隨著大片段DNA克隆技術(shù)的發(fā)展，在優(yōu)化的宿主菌株中進(jìn)行整個(gè)合成基因簇的復(fù)制或者異源表達(dá)，有望大幅度提高抗生素的產(chǎn)量^[39]。目前已有許多抗生素實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，這也為抗生素的高產(chǎn)提供了有利條件。通過(guò)利用Red/ET同源重組技術(shù)在B. amyloliquefaciens FZB42中克隆了桿菌霉素的合成基因簇 (37.2 kb)，然后將克隆的基因簇整合到枯草芽孢桿菌的染色體上實(shí)現(xiàn)了桿菌霉素的異源表達(dá)^[42]；以S. coelicolor M145的衍生物菌株M1152和M1154作為宿主，通過(guò)在φC31 att位點(diǎn)分別引入來(lái)自S. venezuelae ATCC 10712的氯霉素基因簇和S. ambofaciens ATCC 23877的殺剛果錐蟲(chóng)素基因簇，使氯霉素和殺剛果錐蟲(chóng)素的產(chǎn)量提高了20–40倍^[43]。

2.2.2  利用底盤(pán)細(xì)胞構(gòu)建高產(chǎn)菌株

由于缺乏高效的遺傳操作技術(shù)、生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)量低或易受環(huán)境干擾等原因，許多天然微生物并不是抗生素等代謝產(chǎn)物的理想生產(chǎn)對(duì)象。因此，在微生物底盤(pán)細(xì)胞中異源表達(dá)天然產(chǎn)物合成途徑引起了越來(lái)越多的關(guān)注。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)工具在途徑識(shí)別、預(yù)測(cè)和重構(gòu)方面的發(fā)展，一些模式微生物，如大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等，已被確定為異源表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)高價(jià)值天然產(chǎn)物的理想底盤(pán)。這些底盤(pán)細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于生長(zhǎng)速度較快，其基因組和代謝網(wǎng)絡(luò)具有很透徹的研究，因此通過(guò)不同的合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行工程化處理，可以實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的高效表達(dá)^[44]。

基因組的精簡(jiǎn)和優(yōu)化是構(gòu)建底盤(pán)細(xì)胞的重要策略，刪減非必需基因不僅可以提高基因組的產(chǎn)物合成穩(wěn)定性，還可以簡(jiǎn)化目標(biāo)代謝網(wǎng)絡(luò)。例如，通過(guò)敲除S. avermiltilis線性染色體9.02 Mb中總長(zhǎng)度超過(guò)1.4 Mb的非必需基因，構(gòu)建了阿維鏈霉菌的“最小基因組”，將這個(gè)最小基因組作為底盤(pán)對(duì)鏈霉素、頭孢霉素C和寡霉素的外源基因簇分別進(jìn)行了異源表達(dá)，使得鏈霉素和頭孢霉素C的產(chǎn)量明顯高于原始菌株，也使得寡霉素的產(chǎn)量提高了10倍以上^[45]。另外，在P. chlororaphis GP72中通過(guò)采用同源重組方法從染色體上敲除685 750 bp的片段 (占基因組的10.3%，包括5個(gè)非必要的次級(jí)代謝基因簇和17個(gè)菌株特異性大片段)，構(gòu)建了小基因組菌株MDS22，并使得MDS22的2-羥基吩嗪產(chǎn)量提高了3.4倍^[46]?；蚪M規(guī)模的代謝重建以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析將會(huì)提供更多信息，為構(gòu)建具有系統(tǒng)簡(jiǎn)單性和生物技術(shù)應(yīng)用可行性的理想底盤(pán)細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

2.2.3  核糖體工程技術(shù)

核糖體工程技術(shù)是利用核糖體蛋白結(jié)構(gòu)上的突變對(duì)微生物次級(jí)代謝調(diào)控產(chǎn)生影響，進(jìn)而進(jìn)行微生物育種的一項(xiàng)技術(shù)，目前已成為激活與提高微生物多種重要次生代謝產(chǎn)物的主要技術(shù)。通過(guò)向核糖體或RNA聚合酶引入特定的抗生素抗性突變，使該菌株核糖體的特定基因發(fā)生突變，賦予目的菌株某種抗生素抗性，從而激活次級(jí)代謝產(chǎn)物合成，迅速提高抗生素產(chǎn)量。相比經(jīng)典的微生物育種方法，核糖體工程技術(shù)具有產(chǎn)量提高迅速、耗時(shí)少、基因突變位點(diǎn)明確且易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可以大幅度提高正向突變菌株的獲得率^[47]。另外，核糖體工程技術(shù)還適用于那些沒(méi)有明確遺傳背景的菌株改造。

利用核糖體工程技術(shù)可以有效地提高抗生素的產(chǎn)量。在S. viridochromogenes Co γ-316中，通過(guò)基因組重排與核糖體工程相結(jié)合的技術(shù) (核糖體蛋白S12突變)，使得阿維菌素的產(chǎn)量從0.24 g/L增加到1.4 g/L，比原始菌株提高了4.85倍^[48]；通過(guò)基因組重排與核糖體工程相結(jié)合對(duì)S. actuosus AW7進(jìn)行改造，使得那西肽的產(chǎn)量增加到1.2 g/L，比親本菌株AW7高7.0倍^[49]；通過(guò)ARTP和核糖體工程技術(shù)相結(jié)合的育種方法對(duì)S. albus S12進(jìn)行改造，使得沙利霉素的產(chǎn)量達(dá)到了34.7 g/L，比原始菌株提高了1倍多^[30]。

基因工程育種可以定向改造微生物，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量，育種周期相對(duì)較短；但是該育種方法需要對(duì)微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行透徹的研究，操作難度較誘變育種大。人們可以根據(jù)菌株的遺傳背景了解程度和改造難度，選擇合適的育種方法。

微生物源農(nóng)用抗生素的篩選以及高產(chǎn)菌株生產(chǎn)能力的鑒定一般都是通過(guò)發(fā)酵實(shí)現(xiàn)的，發(fā)酵過(guò)程會(huì)受到各種因素 (如營(yíng)養(yǎng)因素、氧氣供應(yīng)、溫度、pH值等) 的影響，進(jìn)而影響微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成水平。如在S. hygroscopicus 5008發(fā)酵過(guò)程中，采用堿性pH沖擊使得井岡霉素A的產(chǎn)量提高了27.43%^[50]；在微生物發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加適當(dāng)?shù)难趸瘎?、還原劑等調(diào)節(jié)活性氧 (Reactive oxygen species，ROS) 水平，也可以起到增加次級(jí)代謝物產(chǎn)量的作用。通過(guò)在S. hygroscopicus 5008的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加H₂O₂，并對(duì)其添加濃度和添加時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，使得井岡霉素A的產(chǎn)量獲得了顯著的提升^[51]；在假單胞菌中通過(guò)在不同的時(shí)間添加二硫蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT) 和H₂O₂，運(yùn)用兩步發(fā)酵策略使得2-OH-PHZ的產(chǎn)量提高了1.6倍，這些可為其他抗生素的發(fā)酵提供借鑒^[52]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)多以單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)為主，研究耗時(shí)、模型指導(dǎo)性較差。近年來(lái)，優(yōu)秀試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件不斷推廣，大大提高了高產(chǎn)條件的優(yōu)化研究速度。目前通過(guò)使用Plackett-Burman (PB) 設(shè)計(jì)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (Box-Behnken design，BBD)、中心復(fù)合設(shè)計(jì) (Central composite design，CCD)、響應(yīng)曲面法 (Response surface method，RSM) 等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化，使得次級(jí)代謝物產(chǎn)量提升的同時(shí)也有效地降低了發(fā)酵成本，同時(shí)還可以采用數(shù)學(xué)模型指導(dǎo)優(yōu)化過(guò)程。通過(guò)對(duì)PCA高產(chǎn)菌株銅綠假單胞菌M18MSU1采用部分析因設(shè)計(jì) (Fractional factorial design，FFD)、最陡爬坡法和CCD進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并確定優(yōu)化條件，使得PCA產(chǎn)量達(dá)到4 771 mg/L，約是優(yōu)化前的2倍^[53]；通過(guò)采用PB設(shè)計(jì)和CCD對(duì)綠針假單胞菌P3Δlon菌株進(jìn)行培養(yǎng)基參數(shù)的優(yōu)化，使得PCN產(chǎn)量提高了3倍左右，其PCN產(chǎn)量達(dá)到了9 174 mg/L^[15]；通過(guò)對(duì)井岡霉素A的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并采用RSM進(jìn)行最優(yōu)化選擇和驗(yàn)證，使得井岡霉素A的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了近2倍^[54]。

隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，影響抗生素合成的前體不斷得到確定，添加前體或者關(guān)鍵代謝物也是提高抗生素產(chǎn)量的常用手段，在束絲放線菌Actinosynnema pretiosum發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加前體異丁醇，使得安絲菌素P-3的產(chǎn)量提高了4倍左右^[55]；S. nodosus可以產(chǎn)生一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素-兩性霉素B，在24 h時(shí)通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加異丙醇、丙氨酸、丙酮酸和煙酰胺使得兩性霉素B的產(chǎn)量提高了28.5%^[56]。

農(nóng)作物病蟲(chóng)害一直以來(lái)都是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，而化學(xué)農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人類健康等產(chǎn)生了一系列的負(fù)面影響，高效、低毒、無(wú)殘留的微生物源農(nóng)用抗生素具有很好的市場(chǎng)發(fā)展前景，能夠促進(jìn)綠色生產(chǎn)，提升農(nóng)業(yè)生產(chǎn)品質(zhì)。微生物源農(nóng)用抗生素經(jīng)過(guò)20世紀(jì)70年代開(kāi)始的輝煌，在21世紀(jì)初進(jìn)入發(fā)展瓶頸，但基因組學(xué)、代謝工程、合成生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展將推動(dòng)微生物源農(nóng)用抗生素的再次發(fā)展，并推進(jìn)傳統(tǒng)農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的結(jié)構(gòu)調(diào)整和技術(shù)提升，將農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)業(yè)帶上一個(gè)更高的臺(tái)階。

張雪洪

博士，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系教授、微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任。

長(zhǎng)期從事生物工程上下游的教學(xué)和研究，主要研究方向?yàn)槲⑸锎x工程與合成生物學(xué)、生物物質(zhì)的分離純化、農(nóng)業(yè)生物藥物等。曾任上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院常務(wù)副院長(zhǎng)，任上海市化學(xué)化工學(xué)會(huì)理事、生物技術(shù)與工程專業(yè)委員會(huì)副主任。曾主持國(guó)家“863”計(jì)劃和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的課題、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目等，在生物工程和微生物學(xué)等領(lǐng)域相關(guān)期刊發(fā)表SCI文章120余篇。

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