細(xì)胞免疫療法涉及活細(xì)胞給藥，基因修飾的免疫細(xì)胞可以增殖、適應(yīng)環(huán)境、與周圍細(xì)胞建立聯(lián)系，進(jìn)而引發(fā)直接或間接針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行破壞的動(dòng)態(tài)反應(yīng)。過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移是細(xì)胞免疫治療的一種，它涉及直接靶向患者腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移，例如CAR-T細(xì)胞療法，在血液類癌癥中取得了令人矚目的治療效果。目前已有6款CAR-T細(xì)胞療法獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。

為了應(yīng)對(duì)不同腫瘤和腫瘤環(huán)境所帶來的許多挑戰(zhàn)，除了CAR-T細(xì)胞之外，還誕生了多種其他基于細(xì)胞的免疫治療方法，例如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）、T細(xì)胞受體工程T細(xì)胞（TCR-T）、CAR-NK細(xì)胞、CAR-巨噬細(xì)胞，以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）驅(qū)動(dòng)的治療性免疫細(xì)胞療法。

目前，臨床試驗(yàn)中使用的大多數(shù)CAR-T細(xì)胞是使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒進(jìn)行基因遞送產(chǎn)生的。然而，這些病毒載體存在一些限制，例如，遞送進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能被沉默或抑制。此外，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢性毒在宿主細(xì)胞基因組的整合可能具有致癌風(fēng)險(xiǎn)。腺相關(guān)病毒（AAV）被認(rèn)為是一種更安全的基因治療載體，然而，AAV并不是理想的CAR遞送載體，因?yàn)樗欠钦系?，因此在T細(xì)胞擴(kuò)增過程中，CAR的表達(dá)會(huì)被迅速稀釋。

耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳斯迪團(tuán)隊(duì)（第一作者葉露鵬現(xiàn)為南京大學(xué)現(xiàn)代生物研究院研究員）在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 上發(fā)表了題為：AAV-mediated delivery of a Sleeping Beauty transposon and an mRNA-encoded transposase for the engineering of therapeutic immune cells 的研究論文。

該研究建立了一種集合了腺相關(guān)病毒（AAV）、睡美人轉(zhuǎn)座子和mRNA的優(yōu)點(diǎn)的細(xì)胞遺傳改造平臺(tái)——MAJESTIC，MAJESTIC可用于治療性免疫細(xì)胞的高效制備，為臨床細(xì)胞治療（例如CAR-T、CAR-NK）提供了全新的技術(shù)支撐。

葉露鵬（左），陳斯迪（右）

病毒遞送載體存在著一些局限，然而，目前所有的非病毒細(xì)胞治療方法也有其局限性。電穿孔遞送mRNA是另一種CAR-T細(xì)胞生成策略，但由于mRNA的不穩(wěn)定性，CAR表達(dá)的持續(xù)時(shí)間很短。

PiggyBac和睡美人（Sleeping Beauty）等轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可用于直接將DNA序列整合到基因組中，具有相當(dāng)于慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也因其非致病性起源而受到關(guān)注。但目前用于治療性細(xì)胞生成的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶方法主要依賴于DNA電穿孔或質(zhì)粒、微環(huán)DNA的轉(zhuǎn)染，但其遞送效率在不同的研究中有所不同，并且細(xì)胞毒性通常很高。此外，轉(zhuǎn)座酶反復(fù)動(dòng)員轉(zhuǎn)座子可能導(dǎo)致插入性突變或局部染色體重排的持續(xù)風(fēng)險(xiǎn)。

截至目前，所有的細(xì)胞治療工程方法，無論是基于病毒還是非病毒遞送方法，都存在一些重要的局限性。在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)出一種非CRISPR基因遞送方法，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定整合的治療性免疫細(xì)胞，且具有以下特點(diǎn)：1）在不依賴逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的情況下實(shí)現(xiàn)高效的基因組整合；2）理論上限制轉(zhuǎn)座子動(dòng)員程度；3）與現(xiàn)有方法相比，生成的免疫細(xì)胞具有更高的生存能力；4）無需基因編輯。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)將腺相關(guān)病毒（AAV）、睡美人轉(zhuǎn)座子和mRNA的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合，開發(fā)了一種細(xì)胞遺傳改造平臺(tái)——MAJESTIC（mRNA AAV–SB joint engineering of stable therapeutic immune cells）。

在MAJESTIC中，mRNA組件編碼一個(gè)轉(zhuǎn)座酶，該轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)睡美人轉(zhuǎn)座子的基因組整合，睡美人轉(zhuǎn)座子攜帶目的基因（例如表達(dá)CAR），通過AAV進(jìn)行遞送。

質(zhì)粒DNA比mRNA更穩(wěn)定，每次復(fù)制可產(chǎn)生多個(gè)mRNA拷貝，將轉(zhuǎn)座酶作為mRNA遞送，可以限制其再活化和可能帶來的染色體重排。

研究團(tuán)隊(duì)將這一基因遞送系統(tǒng)命名為MAJESTIC（mRNA AAV–SB joint engineering of stable therapeutic immune cells），與慢病毒載體和通過電穿孔遞送的轉(zhuǎn)座子DNA或小環(huán)形DNA相比，MAJESTIC系統(tǒng)能夠提供更長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，以及更高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，治療性工程化免疫細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞活力。

MAJESTIC系統(tǒng)可以將嵌合抗原受體（CAR）遞送到T細(xì)胞，用來構(gòu)建具有強(qiáng)大的體內(nèi)抗腫瘤效果的CAR-T細(xì)胞。此外，該系統(tǒng)還可以將雙特異性CAR、殺傷開關(guān)CAR和合成T細(xì)胞受體地送到自然殺傷細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）中。