巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中不可或缺的組成部分，廣泛分布在不同組織中，并在發(fā)育、器官形成、穩(wěn)態(tài)維持和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用【1】。巨噬細(xì)胞異質(zhì)性顯著，主要表現(xiàn)在形態(tài)、定位、基因表達(dá)譜及功能等方面，這些表型由巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源和駐留的微環(huán)境所決定【2】。具有組織特異性特征的巨噬細(xì)胞包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）、肝臟的枯否細(xì)胞（Kupffer cells）和表皮的朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells）等。還有一些分布于多個(gè)器官的巨噬細(xì)胞，如血管周圍巨噬細(xì)胞（Perivascular macrophages）。

基于嚙齒類動(dòng)物的研究結(jié)果，學(xué)術(shù)界對(duì)巨噬細(xì)胞亞型的多樣性、發(fā)育起源以及組織特異性的形成有了一定的認(rèn)識(shí)【3】。然而，這些發(fā)現(xiàn)是否適用于人類仍是未知數(shù)，特別是人類胚胎發(fā)育過程中巨噬細(xì)胞的多樣性、發(fā)育起源、功能及成熟的動(dòng)態(tài)過程等問題還缺乏深入而全面的研究。

2023年9月12日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李漢杰課題組聯(lián)合深圳市寶安區(qū)婦幼保健院、深圳大學(xué)、上海交通大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)等單位在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Cell 上發(fā)表了題為：An immune cell atlas reveals the dynamics of human macrophage specification during prenatal development 的研究論文。

研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、先進(jìn)的生物信息學(xué)手段、多重免疫熒光染色、體外功能實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，構(gòu)建了橫跨18個(gè)發(fā)育階段、19種組織的人類胚胎免疫系統(tǒng)發(fā)育高分辨率圖譜。研究團(tuán)隊(duì)重點(diǎn)關(guān)注了最具組織特異性的巨噬細(xì)胞，鑒定了15種巨噬細(xì)胞亞型，其中包括兩種新的巨噬細(xì)胞亞型，即存在于表皮、睪丸、心臟等外周組織的類小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia-like cells）和具有血管生成促進(jìn)功能并廣泛分布于多個(gè)組織中的促血管生成巨噬細(xì)胞（Proangiogenic macrophages，PraM）。

該研究通過構(gòu)建人類產(chǎn)前免疫細(xì)胞發(fā)育的時(shí)空動(dòng)態(tài)圖譜，揭示了多種巨噬細(xì)胞亞型在發(fā)育過程中的分化起源、空間定位、功能特征及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

人類免疫系統(tǒng)發(fā)育的單細(xì)胞時(shí)空?qǐng)D譜

研究團(tuán)隊(duì)對(duì)來自受孕后4-26 PCW（Postconceptional Week，PCW）囊括19種人類胚胎組織樣本的免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了近30萬個(gè)高質(zhì)量的免疫細(xì)胞

（圖1），并鑒定了11種主要的免疫細(xì)胞類型，包括：巨噬細(xì)胞（Macrophages）、祖細(xì)胞（Progenitor cells）、B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞（Innate-like lymphocytes）、自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cells）、樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells）、單核細(xì)胞（Monocytes）、巨核細(xì)胞（Megakaryocytes）、粒細(xì)胞（Granulocytes）和紅細(xì)胞（Erythrocytes）。在此基礎(chǔ)之上，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)每一種主要的免疫細(xì)胞類型進(jìn)行了更細(xì)致的分類，最終注釋得到56種免疫細(xì)胞亞型。

研究團(tuán)隊(duì)重點(diǎn)對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了研究并將其進(jìn)一步細(xì)分為了15個(gè)亞群。通過時(shí)空分析，他們發(fā)現(xiàn)在人類胚胎發(fā)育時(shí)期，巨噬細(xì)胞就已經(jīng)具有了顯著的組織特異性。在4 PCW左右（器官初形成階段），巨噬細(xì)胞前體就已經(jīng)出現(xiàn)在胚胎以及卵黃囊中并一直持續(xù)到大概8 PCW，直到被成熟的組織駐留巨噬細(xì)胞所替代。

圖1 構(gòu)建人類免疫系統(tǒng)發(fā)育時(shí)空?qǐng)D譜

中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的類小膠質(zhì)細(xì)胞

在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)首次在胚胎多個(gè)外周組織（皮膚、心臟及睪丸）中鑒定出一群和小膠質(zhì)細(xì)胞有相似基因表達(dá)譜特征的巨噬細(xì)胞（圖2）。這一發(fā)現(xiàn)打破小膠質(zhì)細(xì)胞只存在于腦及脊髓中的傳統(tǒng)認(rèn)知。這群細(xì)胞高表達(dá)P2RY12、TMEM119、SALL1、C3等和小膠質(zhì)細(xì)胞相同的特征基因，并且在無監(jiān)督聚類分析中，這群細(xì)胞也和腦、脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞聚為一類。研究人員因此將這群新發(fā)現(xiàn)的分布在多個(gè)外周組織的細(xì)胞命名為類小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia-like cells）。

流式分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這群外周組織中的類小膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞一樣，都呈現(xiàn)CD45lowP2RY12+MRC1-的表型。此外，基于多重免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)類小膠質(zhì)細(xì)胞在Carnegie Stages 12（CS12）時(shí)期就已經(jīng)出現(xiàn)在表皮組織中。在14 PCW之前，類小膠質(zhì)細(xì)胞一直是表皮中最主要的免疫細(xì)胞，此后細(xì)胞比例才開始逐漸減少，在20 PCW之后，基本被朗格漢斯細(xì)胞替代。在胚胎心臟中，類小膠質(zhì)細(xì)胞最早出現(xiàn)在CS13的主動(dòng)脈（aorta）中，并且在26 PCW之前一直是主動(dòng)脈中最主要的免疫細(xì)胞。而成人主動(dòng)脈組織中則檢測(cè)不到這群類小膠質(zhì)細(xì)胞。在胚胎睪丸中，類小膠質(zhì)細(xì)胞最早能夠在CS14的時(shí)候被檢測(cè)到，主要存在于附睪（epididymis）中的輸出小管（efferent duct）周圍，而在睪丸實(shí)質(zhì)（parenchyma）中比例則較低。

圖2 外周器官中的類小膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞的表型一致

表皮和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均起源于外胚層，而主動(dòng)脈和附睪則起源于主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros，AGM）區(qū)域。研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)，小膠質(zhì)細(xì)胞以及類小膠質(zhì)細(xì)胞的前體從卵黃囊遷移到外胚層和AGM區(qū)域，隨后在這兩個(gè)區(qū)域獨(dú)立分化為小膠質(zhì)細(xì)胞或類小膠質(zhì)細(xì)胞。

表皮駐留的類小膠質(zhì)細(xì)胞呈極化分布，與神經(jīng)嵴細(xì)胞互作并調(diào)控其分化

由于類小膠質(zhì)細(xì)胞在表皮中最為豐富，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究了它們?cè)诒砥そM織中的功能。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，與四肢和腹部皮膚相比，類小膠質(zhì)細(xì)胞在背部和頭部表皮中比例更高。在9 PCW時(shí)，背部表皮中幾乎所有的免疫細(xì)胞都是類小膠質(zhì)細(xì)胞，而四肢表皮中約60%的免疫細(xì)胞是類小膠質(zhì)細(xì)胞。進(jìn)一步定量分析表明，在胚胎發(fā)育不同階段，背部表皮的類小膠質(zhì)細(xì)胞都比四肢表皮更多，分布更密集（圖3）。

類小膠質(zhì)細(xì)胞在表皮中的極化分布模式與神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells，NCCs）的背外側(cè)遷移路線（dorsolateral migration）有類似之處，因此研究人員猜測(cè)表皮的類小膠質(zhì)細(xì)胞與NCCs之間可能存在某種互作。NCCs是外胚層衍生的多能干細(xì)胞，背外側(cè)遷移時(shí)可分化為黑色素細(xì)胞（melanocytes）。通過多重免疫熒光實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)表皮中的類小膠質(zhì)細(xì)胞和NCCs之間存在直接的相互作用。與之一致的是，研究團(tuán)隊(duì)觀察到類小膠質(zhì)細(xì)胞和黑色素母細(xì)胞（melanoblasts）的密度在不同發(fā)育階段沿表皮的背-側(cè)-腹軸（dorsal-lateral-ventral axis）逐漸降低（圖3）。

為了評(píng)估類小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化的影響，研究團(tuán)隊(duì)體外培養(yǎng)了來源于胚胎背部的新鮮皮膚組織塊。在胚胎皮膚中清除類小膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少了黑色素母細(xì)胞的數(shù)量，這提示了類小膠質(zhì)細(xì)胞可能會(huì)調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞向黑色素細(xì)胞的分化（圖3）。

圖3 表皮駐留的類小膠質(zhì)細(xì)胞呈極化分布，與神經(jīng)嵴細(xì)胞互作并調(diào)控其分化

廣泛分布于多個(gè)臟器中的促血管生成巨噬細(xì)胞

研究團(tuán)隊(duì)在多個(gè)臟器中都鑒定到了一群高表達(dá)促血管生成基因（VEGFA、TNF、IL1B、CXCL8/IL8）的巨噬細(xì)胞，并且這群細(xì)胞在不同組織中都具有相似的基因表達(dá)譜。體外成管實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這群細(xì)胞促血管生成的功能。他們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這群細(xì)胞在各個(gè)臟器中都富集在血管周圍（圖4）。

圖4 促血管生成巨噬細(xì)胞富集在各個(gè)器官血管周圍

研究團(tuán)隊(duì)又進(jìn)一步分析了這群促血管生成巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源。通過多種擬時(shí)序分析算法推斷這群細(xì)胞是從卵黃囊起源的巨噬細(xì)胞前體分化而來，并且中間經(jīng)歷了一個(gè)相對(duì)不成熟的前體狀態(tài)（pre-PraM）。擬時(shí)序分析推算出的分化軌跡與細(xì)胞的真實(shí)采樣時(shí)間高度一致，并且其促血管生成信號(hào)也在隨之增強(qiáng)。此外，研究團(tuán)隊(duì)用成管的內(nèi)皮細(xì)胞上清液培養(yǎng)來源于卵黃囊的早期巨噬細(xì)胞前體，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)出表達(dá)促血管生成基因的巨噬細(xì)胞。這些結(jié)果明確了這群促血管生成巨噬細(xì)胞的發(fā)育起源。

總而言之，該研究通過對(duì)人類產(chǎn)前階段近30萬個(gè)免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，著重描繪了15種巨噬細(xì)胞亞型的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。突破性的發(fā)現(xiàn)了一群在轉(zhuǎn)錄組、特征蛋白表達(dá)、和形態(tài)上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞類似且存在于皮膚、睪丸和心臟中的類小膠質(zhì)細(xì)胞。它們是早期表皮中的主要免疫細(xì)胞群，沿背-側(cè)-腹軸呈極化分布。這群類小膠質(zhì)細(xì)胞可以與神經(jīng)嵴細(xì)胞相互作用，并調(diào)節(jié)其向黑色素細(xì)胞的分化。通過功能、空間特征、分化軌跡的研究，研究團(tuán)隊(duì)還細(xì)致解析了一種尚未被充分了解的促血管生成巨噬細(xì)胞，它們駐留在多個(gè)器官的血管周圍。這些促血管生成巨噬細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均從起源于卵黃囊的巨噬細(xì)胞前體分化而來（圖5）。

圖5 巨噬細(xì)胞前體分化為小膠質(zhì)細(xì)胞/類小膠質(zhì)細(xì)胞和促血管生成巨噬細(xì)胞；類小膠質(zhì)細(xì)胞在表皮與神經(jīng)嵴細(xì)胞互作，并調(diào)控其分化

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院李漢杰研究員、深圳市寶安區(qū)婦幼保健院朱元方教授、深圳大學(xué)總醫(yī)院吳雪清教授、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院Florent Ginhoux教授、復(fù)旦大學(xué)代謝與整合生物學(xué)研究院青年研究員王冠琳博士為論文共同通訊作者。中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院客座學(xué)生王澤帥（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生）、吳志生（東南大學(xué)博士研究生）、研究助理馮若輕；深圳市寶安區(qū)婦幼保健院母胎醫(yī)學(xué)研究所陳曉燕博士、王昊博士；復(fù)旦大學(xué)代謝與整合生物學(xué)研究院青年研究員王冠琳博士，廈門大學(xué)博士研究生李沐曦、以色列魏茨曼研究所王雙寅博士為論文共同第一作者，深圳先進(jìn)院為第一單位。

論文特別致謝了深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，在研究課題開展過程中，尤其是在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)前的細(xì)胞分選及建庫(kù)早期的關(guān)鍵步驟中需要使用大量384孔板，合成生物大設(shè)施的自動(dòng)化、高通量平臺(tái)發(fā)揮了不可替代的作用。在研究過程中，僅需要兩到三名工作人員在一天內(nèi)就能夠制備上千塊孔板，且每一塊均能夠按照實(shí)驗(yàn)要求添加細(xì)胞裂解液和引物，從而保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。合成生物大設(shè)施高效的工作方式使研究工作得到快速推進(jìn)。研究團(tuán)隊(duì)期待未來能夠繼續(xù)與大設(shè)施合作，在合成生物學(xué)領(lǐng)域取得更多突破。

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