單抗融合是一項關鍵的生物技術實驗，用于制備單克隆抗體。以下是一份詳細的單抗融合操作步驟指南，基于最新的實驗技術和實踐。

一、實驗準備

1. 實驗器材與試劑

在開始實驗前，請確保以下器材和試劑已準備齊全：

·         細胞融合所需器材：離心管、離心管架、剪子、鑷子、勻漿器、細胞篩網、培養(yǎng)皿、固定板等。

• 細胞融合所需試劑：1640不完全培養(yǎng)基MAC0016、PEG融合劑（如PEG1450）MAC0011、HAT完全培養(yǎng)基MAC0013、胎牛血清MAC0010、雙抗（鏈霉素和青霉素）、HAT或HT選擇性培養(yǎng)基等。

2. 試劑配制

·         實驗前取PEG融合劑（如PEG1450）1ml于無菌EP管中，置于37℃預溫。

·         HAT完全培養(yǎng)基：按照20%胎牛血清+1%雙抗+1/50體積的HAT（50×）+1640不完全培養(yǎng)基的比例配制，每塊96孔板約需20ml，同樣置于37℃預溫。

·         分取50ml 1640不完全培養(yǎng)基，同樣置于37℃預溫，用于融合后稀釋PEG。

二、實驗前準備工作

·         將實驗所需器材放入超凈臺，紫外照射30分鐘左右，以確保無菌環(huán)境。

三、飼養(yǎng)細胞與融合細胞準備

1. 飼養(yǎng)細胞的制備

飼養(yǎng)細胞可以輔助融合雜交瘤細胞的生長，但也可能增加污染風險，需謹慎操作。

·         取空白Balb/c小鼠，眼球取血處死，浸入75%乙醇中消毒5分鐘。

·         將小鼠固定在無菌固定板上，剖開腹部皮膚，用注射器向腹腔內注入1640不完全培養(yǎng)基，輕輕按摩后回收。

·         取出小鼠脾臟，剪去表面脂肪，放入勻漿器中研磨，并通過細胞篩網過濾。

·         將過濾后的細胞懸液離心，棄上清，重懸于HAT完全培養(yǎng)基中，即可用于鋪板或混合鋪板。

2. SP2/0細胞制備

SP2/0細胞MAC0022作為骨髓瘤細胞，是單抗融合的重要組成部分。

·         對于培養(yǎng)細胞，直接吹打懸浮后離心計數(shù)使用。

·         對于實體瘤SP2/0，需按飼養(yǎng)細胞制備步驟處理小鼠，取出實體瘤后研磨、過濾、離心，重懸于1640不完全培養(yǎng)基中備用。

四、單抗融合操作步驟

1. 細胞混合與離心

·         用1640不完全培養(yǎng)基將SP2/0細胞和免疫鼠脾細胞重懸，分別計數(shù)后按一定比例（如脾細胞/0細胞=1:3）混合于50ml無菌離心管中。

·         加入適量1640不完全培養(yǎng)基至總體積約40ml，離心（如1500rpm，5分鐘）使細胞沉淀。

2. 融合劑PEG的加入與稀釋

·         離心后棄去上清液及管壁液體，輕輕敲打離心管底部使細胞沉淀松動。

·         將離心管底部浸入37℃溫水中保持溫度。

·         從培養(yǎng)箱中取出已預溫的PEG融合劑，在60秒內均勻滴入細胞混合沉淀中，邊滴加邊轉動離心管。

·         靜置溫育45秒后，開始稀釋融合劑。取出預熱的1640不完全培養(yǎng)基，先取1ml在60秒內均勻滴入沉淀中，再取1ml在30秒內滴入，最后將剩余的45ml培養(yǎng)基慢慢滴入并混勻。

3. 細胞重懸與鋪板培養(yǎng)

·         稀釋融合劑后，輕輕顛倒混勻離心管內的細胞懸液，再次離心（如1500rpm，5分鐘）并棄去上清液。

• 用含有飼養(yǎng)細胞的HAT完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀（如總體積200ml）。若飼養(yǎng)細胞已提前鋪板，則只需用100ml的HAT完全培養(yǎng)基重

·         將重懸后的細胞均勻鋪入96孔細胞培養(yǎng)板中（如200μl/孔），置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

·         培養(yǎng)7天后，用HAT完全培養(yǎng)基換液一半。根據(jù)實驗需要，也可選擇半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式。

五、雜交瘤細胞篩選與亞克隆

1. 陽性細胞孔的篩選

·         一般采用間接ELISA法篩選陽性細胞孔。需先確定抗原最佳包被濃度并建立好ELISA檢測方法。

·         按最佳包被濃度包被ELISA板后，加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行檢測。根據(jù)OD值選取陽性值最高的孔予以保留并進行亞克隆。

2. 陽性雜交瘤細胞的亞克隆

·         亞克隆的目的是為了得到單個細胞（單克隆）分裂生長的細胞群。一般采用有限稀釋法或半固體培養(yǎng)基法進行亞克隆。

·         在亞克隆過程中需使用HT完全培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基以促進雜交瘤細胞的生長和分化。

六、注意事項

·         在整個實驗過程中需嚴格遵守無菌操作規(guī)范以防止污染。

·         融合劑PEG的分子量和濃度需根據(jù)實驗需求進行選擇和優(yōu)化。

• 飼養(yǎng)細胞的使用需謹慎操作以避免對融合造成負面影響。

• 特別推薦使用用雜交瘤添加因子10×MAC0014

·         在雜交瘤細胞篩選和亞克隆過程中需耐心觀察和細致操作以確保實驗成功。

以上單抗融合操作步驟僅供參考，具體實驗條件可能因實驗室設備、試劑品牌等因素而有所不同。在實際操作中請根據(jù)實際情況進行調整和優(yōu)化。另外推出單抗融合套裝MAC0001，新手操作首選.