作為源自C57BL/6小鼠的經(jīng)典乳腺癌模型，E0771細(xì)胞因其優(yōu)異的免疫兼容性及對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的高度敏感性，已成為乳腺癌免疫治療、免疫檢查點(diǎn)抑制研究及基因編輯建模等熱門(mén)領(lǐng)域的核心工具。從CAR-T療法功能驗(yàn)證到CRISPR高通量篩選平臺(tái)的構(gòu)建，E0771細(xì)胞始終是科研工作者手中值得信賴(lài)的“利器”，助力深入探索腫瘤與免疫的前沿交匯。本文將全面梳理E0771細(xì)胞的使用要點(diǎn)，分享一線(xiàn)科研人員總結(jié)的培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)與高效基因編輯技巧，助你高效推進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，輕松拿下科研關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

細(xì)胞信息

細(xì)胞名稱(chēng)：E0771（小鼠髓樣乳腺癌細(xì)胞）

細(xì)胞形態(tài)：呈上皮樣，貼壁細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)條件：90%DMEM+10%FBS

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%

溫度：37℃

換液頻次：2-3天/次細(xì)胞

傳代比例：1:2-1:4

細(xì)胞生長(zhǎng)正常圖片：以貼壁形式生長(zhǎng)，單層鋪展，通常呈多角形或梭形，細(xì)胞邊界清晰。

細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差圖片：細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞變圓、漂浮增多；細(xì)胞出現(xiàn)空泡；細(xì)胞坍塌不立體，細(xì)胞出現(xiàn)老化。

1)準(zhǔn)備：取7mL完全培養(yǎng)基于離心管中備用

2)解凍：將細(xì)胞從干冰里取出，用鑷子夾住蓋子放入 37℃水浴中快速晃動(dòng)（注意：水不能沒(méi)過(guò)蓋子），使其在1分鐘左右完全融化，直至冰塊融化至綠豆大小，停止水浴

3)離心：將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1100rpm條件下離心4分鐘，棄去上清液

4)重懸與接種：用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于合適大小的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中

5)培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)及貼壁情況

細(xì)胞傳代（以T25瓶為例）

1)當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%時(shí)可進(jìn)行傳代，傳代時(shí)在超凈臺(tái)內(nèi)棄去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液，加入5mLPBS洗滌細(xì)胞1-2次

2)加入1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)瓶子并使胰酶完全浸過(guò)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育 1-3分鐘，待在顯微鏡下觀(guān)察到大部分細(xì)胞變圓變亮，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)有大部分細(xì)胞脫落時(shí)，立即終止消化

3)加入2倍胰酶體積即2mL完全培養(yǎng)基終止消化，然后轉(zhuǎn)移至15mL離心管中

4)1100 rpm 室溫離心 4 分鐘，離心結(jié)束，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞

5)細(xì)胞按照1:2-1:4比例傳代，傳代第二天觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)

細(xì)胞凍存

1)收集細(xì)胞：按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中

2)離心：1100rpm條件下離心4分鐘，去掉上清

3)重懸與凍存：用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，按每1mL凍存液含1×10^6個(gè)細(xì)胞/mL分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng)、代數(shù)、日期等信息

4)降溫與儲(chǔ)存：將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮罐內(nèi)保存

注意： 細(xì)胞速度較快，需合理控制傳代比例；
細(xì)胞換液時(shí)請(qǐng)先預(yù)熱培養(yǎng)基，防止細(xì)胞收縮；若細(xì)胞出現(xiàn)收縮現(xiàn)象，建議消化后進(jìn)行1：1傳代即可

細(xì)胞狀態(tài)差如何調(diào)整

1.培養(yǎng)基和血清：確保使用正確的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，盡可能使用優(yōu)質(zhì)胎牛血清或根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整血清比例

2.細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境：確認(rèn)培養(yǎng)溫度、濕度、氣象條件是否正常

3.避免使用過(guò)期或長(zhǎng)時(shí)間存放的培養(yǎng)基，新鮮配制的完全培養(yǎng)基建議在兩周內(nèi)使用完畢

4.細(xì)胞傳代操作：細(xì)胞傳代時(shí)，注意消化時(shí)間和胰酶濃度，避免因消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短導(dǎo)致的細(xì)胞損傷

5.消化過(guò)度或培養(yǎng)基pH值異常：縮短消化時(shí)間和調(diào)整培養(yǎng)基地pH

6.細(xì)胞聚集成團(tuán)：消化后輕柔吹打（使用槍頭反復(fù)吹吸至單細(xì)胞懸液）；可嘗試用Accutase替代胰酶（溫和解離細(xì)胞）

細(xì)胞老化如何調(diào)整

1.確認(rèn)培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)環(huán)境是否正確

2.避免胰酶消化過(guò)度：合適的胰酶濃度和消化時(shí)間，避免用力吹打，造成細(xì)胞損傷

3.增加血清濃度/選擇高質(zhì)量胎牛血清

4.調(diào)整細(xì)胞密度：細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足和代謝廢物積累，從而加速細(xì)胞老化，應(yīng)將細(xì)胞密度控制在適宜范圍內(nèi)

5.添加生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，有助于改善細(xì)胞老化狀態(tài)

6.換低代次細(xì)胞

7.通過(guò)挑選單克隆等方法，從老化的細(xì)胞群體中篩選出具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單克隆細(xì)胞，進(jìn)行純化培養(yǎng)

E0771細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)注意事項(xiàng)

1.確保細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞活性高，分裂旺盛，有利于轉(zhuǎn)染效率的提升，細(xì)胞密度一般在70-80%之間

2.注意細(xì)胞消化時(shí)間，避免過(guò)度消化，對(duì)細(xì)胞造成傷害

3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞要吹打成單細(xì)胞，避免細(xì)胞聚團(tuán)

4.細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)活率≥80%

5.電轉(zhuǎn)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)控制好電轉(zhuǎn)細(xì)胞量，電轉(zhuǎn)后接種到合適的培養(yǎng)板里

6.用電轉(zhuǎn)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)要保證電轉(zhuǎn)后細(xì)胞貼壁率≥70%

8.用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)可能會(huì)變差，此時(shí)可提高血清濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)

9.慢病毒法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)要控制好感染前的細(xì)胞匯合度30-40%之間，不可過(guò)高

10.選用病毒法進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)找到最合適的MOI;感染前添加助染劑 Polybrene

11.對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑使用前需要充分混勻保證其均勻性

12.建議進(jìn)行藥篩預(yù)實(shí)驗(yàn)找到最佳藥篩濃度，以便于轉(zhuǎn)染后進(jìn)行藥篩

E0771鋪單克隆實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.確保鋪克隆實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞狀態(tài)正常，老化細(xì)胞少，建議控制細(xì)胞匯合度在70%左右

2.鋪克隆時(shí)細(xì)胞活率≥85%

3.可先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)找到合適的鋪克隆梯度，避免單克隆占比太低

4.細(xì)胞接種96孔板時(shí)需確保細(xì)胞分布均勻

5.稀釋細(xì)胞計(jì)數(shù)后結(jié)果最好落在1*10^6-2*10^6之間

慢病毒感染圖: