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【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法 摘要：綜述了高效液相色譜(HPLC)法指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用，并通過供試品的制備、標(biāo)準(zhǔn)品的選擇、結(jié)果分析方法來闡述中藥指紋圖譜的應(yīng)用現(xiàn)狀，指出高效液相色譜法應(yīng)用于中藥指紋圖譜中現(xiàn)有不足之處和未來的發(fā)展方向。 關(guān)鍵詞：高效液相色譜；中藥指紋圖譜 Application and Analysis of Fingerprint in Traditional Chinese Medicine by HPLC Abstract:This paper summarized the application of fingerprint of traditional Chinese medicine by HPLC to the quality control.It also reviewed the actuality of fingerprint in traditional Chinese medicine through the preparation for sample,the choice for standard sample,and the method of result analysis.Then pointed out the main problems at present and the prospective future in application of fingerprint of traditional Chinese medicine by HPLC. Key words:HPLC; Fingerprint of Traditional Chinese medicine 當(dāng)前，中藥指紋圖譜技術(shù)在國內(nèi)外已成為一種發(fā)展趨勢。首先是美國食品與藥品管理局(FDA)允許草藥保健品申報資料可以提供色譜指紋圖。世界衛(wèi)生組織(WHO)在1996年草藥評價指導(dǎo)原則中也規(guī)定：如果草藥的活性成分不明，可以提供指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。歐共體也將指紋圖譜監(jiān)控技術(shù)應(yīng)用于植物藥質(zhì)量控制［1］。我國自200008國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》(國藥管注［2000］348號)以來，中藥指紋圖譜的研究成為中藥研究的熱點。國家藥品監(jiān)督管理局要求到2002年末，所有申報的中藥注射劑均應(yīng)有相關(guān)的指紋圖譜資料，包括中藥原料、提取物、產(chǎn)品3種圖譜，3種圖譜的峰形必須有較大的相關(guān)性，否則不予受理［2］。 1 中藥指紋圖譜 中藥指紋圖譜是一種綜合的、宏觀的和可量化的鑒別手段，用以對中藥材和中成藥進行鑒別真?zhèn)危u價原料藥材、半成品和成品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。其基本屬性是“整體性”和“模糊性”。“整體性”是指完整地比較色譜的特征“面貌”；“模糊性”強調(diào)的是對照品與待測樣品指紋圖譜的相似性［3］。指紋圖譜一般包含兩層含義：1.必須反映出該藥材(或成藥)有別于其他任何物質(zhì)；2.對于中藥材，指紋特征還能反應(yīng)出產(chǎn)地和采收期不同而造成的差異；對于中成藥，則能反映出同一產(chǎn)品不同批次間的質(zhì)量差異，差異越小說明藥材(或成藥)的穩(wěn)定性越好［4］。 2 HPLC用于中藥指紋圖譜的情況 文獻分布表明，對中藥指紋圖譜的研究始于1993年，從1993～1999年共發(fā)表11篇［5］，指紋圖譜的研究基本處于未開發(fā)狀態(tài)。而從2000年開始，研究中藥指紋圖譜的文獻呈直線上升趨勢，尤以近2年發(fā)展最快，與指紋圖譜相關(guān)的文獻報道就有上百篇，其中又以高效液相色譜法研究的指紋圖譜居多，高效液相色譜以其應(yīng)用的廣泛性，檢測的精確性成為控制中藥質(zhì)量最主要的檢測方法。至今已有50種中藥材，21種中成藥運用HPLC法測定其指紋圖譜并發(fā)表。 據(jù)文獻統(tǒng)計，目前已對下列中藥材運用HPLC進行了指紋圖譜研究：枸杞、柴胡、新疆雪蓮、夏天無、延胡索、白芍、白鮮皮、板藍根、補骨脂、黃芩、赤芍、川東獐牙菜、川芎、刺五加、大黃、丹參、當(dāng)歸、地黃、茯苓、麻黃、甘草、葛根、馬甲、紅車軸草、紅花、厚樸、懷牛膝、雞血藤、金銀花、綠衣枳實、密花石斛、牛膝、秦艽、人參、西洋參、忍冬、山銀花、山楂、芍藥、水蔓菁、烏拉爾甘草、五味子、石斛、仙茅、旋覆花、淫羊藿、三七、澤瀉、梔子、西紅花。中成藥中采用HPLC進行指紋圖譜研究的有：咳必安膠囊、燈盞花素注射液、白屈菜注射液、板藍根顆粒、補腎方、川芎制劑、丹參注射液、丹參葡萄糖注射液、復(fù)方丹參片、參麥注射液、紅花注射液、紅景天注射劑、黃連解毒湯、脈絡(luò)寧注射液、人參保健品、青銀注射液、三七制劑、三七總皂苷注射液、腎康注射液、香丹注射劑、銀杏葉注射劑。 指紋圖譜可以對樣品的產(chǎn)地、采收時間、加工方法、工藝流程等多方面通過化學(xué)成分的差異來反映中藥材的種屬差異、真?zhèn)舞b別、中成藥的批次差異等等，從而達到控制中藥質(zhì)量的目的。在HPLC指紋圖譜的研究中，我們從以下幾個方面進行分析和討論。 2.1 供試品的制備已研究的指紋圖譜其供試品的制備，提取步驟多較為簡單。如杜程芳等［6］在白鮮皮藥材指紋圖譜研究中采用甲醇回流提取即得供試品，陶玲等［7］在白屈菜注射液指紋圖譜研究中直接將樣品作為供試品進樣。其目的主要是盡可能多的保留供試液中的化學(xué)成分，以期在指紋圖譜中獲得更多的信息。只有在針對特定一類的化學(xué)成分時，采用比較復(fù)雜的提取方法。如聶國朝［8］在枸杞的指紋圖譜研究中，針對類胡蘿卜素采用了離心、萃取等步驟進行了試供品的制備。朱玲英等［9］在大黃藥材蒽醌苷元類成分的指紋圖譜研究中，采用氯仿回流、乙醇回流、過氧化氫和鹽酸回流，乙醚萃取等步驟進行供試品的制備。所以供試品制備的方法合理性也是決定指紋圖譜最終穩(wěn)定可靠的重要因素。 2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇由于中藥的許多化學(xué)成分未知，已制備的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量還很有限，所以在指紋圖譜中存在著譜峰無法確認(rèn)是何化學(xué)成分的問題。一般來說，或加入內(nèi)標(biāo)物，以內(nèi)標(biāo)物的峰面積來比較其它各峰的相對保留峰面積。如張世軒等［10］在測定燈盞花素注射液指紋圖譜研究中，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)物加校正因子法來測定野黃芩苷；或?qū)⒂行С煞肿鳛橹饕獏⒈确澹⒁源朔鍋肀容^相對保留峰面積。如苗愛東等［11］在新疆雪蓮指紋圖譜研究中采用雪蓮的有效成分紫丁香苷為參比峰。指紋圖譜中代表其它化學(xué)成分的色譜峰只能以相對峰面積來進行相對含量分析，這就要求標(biāo)準(zhǔn)品的選擇，既要色譜峰面積較大，又要選擇有代表性的有效成分，這在指紋圖譜中也是決定圖譜準(zhǔn)確性的一個問題。 2.3 結(jié)果分析方法結(jié)果分析方法可分為兩種。一種是測定相對保留時間和相對峰面積，這也是目前采用最多的一種方法。在指紋圖譜中，各化學(xué)成分的相對保留時間比較固定，可以作為定性和真?zhèn)舞b定的依據(jù)，但相對峰面積的比較則存在困難，各產(chǎn)地的藥材同種成分的峰面積差異較大，很難對其進行定量分析。如苗愛東等［11］在新疆雪蓮指紋圖譜研究中7個不同產(chǎn)地的雪蓮各成分含量的相對峰面積比值差別較大。何春年等［12］在葛根藥材HPLC指紋圖譜研究中不同來源的葛根藥材中8個共有峰的相對峰面積相差較大，提示葛根用藥應(yīng)在固定產(chǎn)地的前提下。另一種是聚類分析法，采用離差平方和(Ward’s)法，利用歐氏距離(Euclidean)作為樣品的聚類依據(jù)，以峰面積為樣品譜圖的特征值，將樣品分為幾類。計算樣品與共有模式之間的相似度，即可對樣品進行鑒定、分類和評價［13］。如張克榮等［14］在白芍HPLC指紋圖譜相似度的分析中即采用此法從28個白芍藥材將樣品分為3類。李曉蒙等［15］在秦艽藥材HPLC指紋圖譜研究中也采用了指紋圖譜相似度計算法，得出10批藥材有比較好的一致性，均可作為投料使用。這種分析法去除了人為的主觀評價和誤差，具備較好的客觀性。從研究結(jié)果看，在種屬鑒定方面具有一定的優(yōu)勢。
3 討論
3.1 在中成藥的指紋圖譜研究中，多是固定原料藥材的質(zhì)量、品種，檢測不同批次的樣品，從中找出共有指紋峰進行比較，如張世軒等［10］在燈盞花素注射液測定中，選取了5批燈盞花素注射液的指紋圖譜，來反映批間藥品質(zhì)量的穩(wěn)定性。陶玲等［7］在白屈菜注射液指紋圖譜研究中選取了10批白屈菜注射液的指紋圖譜。所以中藥質(zhì)量的穩(wěn)定，必須建立在中藥材性質(zhì)穩(wěn)定，采收加工產(chǎn)地一致的前提下，才能實現(xiàn)中藥成品質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。在制劑上，已發(fā)表的21種中成藥指紋圖譜研究中14種是注射劑，占到2/3的比例。分析原因一是由于國家逐漸規(guī)范注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，要求注射劑提供中藥原料、中間物、中藥成品的指紋圖譜；二是由于中藥注射劑的制劑工藝要求嚴(yán)格，所含化學(xué)成分比其它劑型的成分相應(yīng)較少，各批間由于工藝造成的成分差別較小，在固定了藥材的前提下，研究的成藥指紋圖譜比較穩(wěn)定，可以用于質(zhì)量控制。 3.3 指紋圖譜的重現(xiàn)性。由于實驗儀器的差異，色譜柱效的影響，以及實驗人員的操作誤差，使得即使建立了一套指紋圖譜，在不同實驗條件下，色譜圖中各成分的相對保留時間，會出現(xiàn)一定的偏差，這在一定程度上影響了指紋圖譜的可比性。在供試品制備時，由于盡可能的簡化了制備過程，造成進入色譜柱的成分較多，對色譜柱有一定的污染，影響色譜柱的壽命。這些問題都是指紋圖譜研究中必須考慮的問題。 3.4 與西藥不同，大部分中藥的化學(xué)成分不完全明確，其中已知的化學(xué)成分往往不能顯示中藥的全部療效，因此采用化學(xué)分析的方法間接地控制中藥質(zhì)量存在著很多困難。目前還無法解析出指紋圖譜中某一峰或某一段峰所代表的藥理作用。單味藥材的化學(xué)成分十分復(fù)雜，而復(fù)方中成藥化學(xué)成分之間的交叉和相互影響更增加了分析結(jié)果的不確定性。缺少對照品和對照實驗又無法保證獲得標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜實驗條件的一致性，兩者之間的差異可能使實驗方法的重現(xiàn)性受到影響［18］。 3.5 中藥指紋圖譜目前還處于起步階段，需要我們做大量的基礎(chǔ)工作，只有當(dāng)中藥化學(xué)成分確定，并不斷收集不同產(chǎn)地，不同采收期及不同加工方法的藥材進行指紋圖譜的研究，建立系統(tǒng)全面的藥材指紋圖譜庫，經(jīng)過十幾年甚至幾十年的研究積累，采用指紋圖譜來控制中藥質(zhì)量的想法才能真正得以實現(xiàn)，中藥質(zhì)量控制任重而道遠(yuǎn)。 ?。?］陳新民.中藥指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及應(yīng)用［J］.中藥研究與信息，2004，6(3)：37. ?。?］呂春平，關(guān)銘.中藥指紋圖譜的應(yīng)用［J］.天津藥學(xué)，2004，16(2)：58. ?。?］王麗霞，萬素君.指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用［J］.中國中醫(yī)藥，2003，8：35. ?。?］蘇薇薇，吳忠.中藥指紋圖譜及計算機信息處理［J］.世界科學(xué)技術(shù)，2001，3(2)：30. ?。?］肖廷超，戴月，鐘萍.中藥指紋圖譜文獻的統(tǒng)計分析［J］.醫(yī)學(xué)情報工作，2004，1：10. ?。?］杜程芳，屠鵬飛.白鮮皮藥材指紋圖譜研究［J］.中國天然藥物，2003，1(2)：94. ?。?］陶玲，曲彩紅，黃際薇，等.白屈菜注射液HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥材，2004，27(5)：376. ?。?］聶國朝.3種枸杞的HPLCDAD圖譜比較［J］.福建林學(xué)院學(xué)報，2004，24(2)162. ?。?］朱玲英，任愛農(nóng)，葛進，等.大黃藥材蒽醌苷元類成分的HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2003，25(6)：438. ?。?0］張世軒，牛玉娟，呂浩然，等.HPLC法測定燈盞花素注射液中野黃芩苷［J］.中成藥，2002，24(2)：95. ［11］苗愛東，孫殿甲，彭燕，等.HPLC法建立新疆雪蓮指紋圖譜研究［J］.中成藥，2003，25(9)：691. ?。?2］何春年，李敏，曹志高，等.葛根藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.中國中藥雜志，2003，28(12)：1141. ?。?3］董彬，孫素琴，秦竹，等.聚類分析法在野生赤芍快速鑒別中的應(yīng)用研究［J］.計算機與應(yīng)用化學(xué)，2002，19(1)：89. ?。?4］張克榮，畢開順.白芍HPLC指紋圖譜相似度的分析［J］.中國中藥雜志，2004，29(4)：380. ?。?5］李曉蒙，何新榮.秦艽藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2004，26(1)：4. ［16］張克榮，畢開順.赤芍HPLC指紋圖譜的研究［J］.中草藥，2003，34(11)：1048. ?。?7］馬翠英，戴寶成，林瑞超.黃芩中4種黃酮的HPLC定量分析及其黃酮類成分指紋圖譜研究［J］.藥物分析雜志，2003，23(2)：83. ?。?8］賈萍.指紋圖譜與中藥質(zhì)量控制［J］.中國藥業(yè)，2004，13(2)：79. |
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