實驗步驟
 實驗原理
 
1 挑取一個JM109單菌落于3ml LB(無抗生素)培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)過夜。 讓菌復蘇，進入對數(shù)期的早中期。此時更容易制得感受態(tài)細胞。 
2 取0.4mL過夜培養(yǎng)物加入到40mL LB(無抗生素)培養(yǎng)基中，37℃250rpm大約2.5小時）。 減少達到所需亮的均所需繁殖的世代數(shù)，以減少菌的變異。 
3 取培養(yǎng)物置于40mL的滅菌離心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃離心10min，棄上清。（將所有上清倒光，可以將離心管倒過來） 使細菌的生長停止，代謝減慢。因為這時已經(jīng)沒有培養(yǎng)基了，如果細菌仍有很高的代謝效率，則有大量細菌死亡。 
4 菌體重懸于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2 中，輕吹，4℃ 30min，4000rpm離心5min棄上清。

 

生物秀實驗頻道
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 細菌處于00C，CaCl2 低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞表面（羥基來源于細胞壁上的糖，磷酸來源于DNA

），經(jīng)短時間420C熱激處理，促進細胞吸收DNA復合物。（一定要輕吹，這時細胞壁打開，十分脆弱）
 
5 菌體重懸于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2 中，輕吹，用于轉化。 除去所有的LB以及細胞破損后釋放出來的細胞內含物。防止細胞分裂，以致大量細胞死亡。（一定要輕吹，這時細胞壁打開，十分脆弱） 
6 取感受態(tài)細胞100uL，加入2uLpET-21a質粒，冰浴30 min受體菌：感受態(tài)細胞100uL，加入2 uL無菌雙蒸水陰性對照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，加入2 uL陰性對照 第一個陰性對照是為了驗證LB中的抗生素有活性；第二個陰性對照是為了驗證CaCl2 溶液和pET-21a質粒未被污染。 冰浴是為了降低細胞代謝率，防止細胞大量死亡。 
7 熱激 42oC，90s 在低溫處理后，熱激，可以使細胞壁熱脹冷縮，再低溫，使細胞壁上黏附的質粒進入細胞體內。 
8 冰浴2 min
9 加入800 uL 無抗生素的 LB，37℃復蘇1h  用LB復蘇細胞，使細胞恢復活力，從而使細胞中的質粒表達抗抗生素的基因，只有這樣才能使轉化成功的細菌在有抗生素的LB平板上生長。 
10 取100ul細胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧芐西林)的LB培養(yǎng)基上鋪平板，將平皿放置37 oC溫箱30min至液體被吸收。倒置平皿37 oC培養(yǎng)過夜，出現(xiàn)菌落。 這些菌落為轉化成功的菌落，而對照組應該沒有菌落。在目的菌落的旁邊有可能出現(xiàn)衛(wèi)星菌落，這是因為畝的菌落的抗性基因似的菌落周圍的抗生素失效，長出了轉化為成功的菌落。用羧芐西林因其對酸穩(wěn)定、不易被細菌降解，所以可以降低衛(wèi)星菌落的數(shù)量。 因為抗生素高溫易失活，所以應等到LB600C時（熱而不燙），加入抗生素。