感受態(tài)細胞

新用戶8331KT28 2020-09-20

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Ca2+誘導的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)。

大腸桿菌CaCl2感受態(tài)細胞的制備

1．劃線接種受體菌（DH5α或DH10B）于平板過夜，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)

過夜（約16小時）；

2．取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時

（250-300 rpm）至OD約0.5；

3．將菌液放在冰水混合物中搖晃冷卻10分鐘；

4．4℃下2500 g離心5分鐘；棄上清，加入100 ml預冷的0.1M CaCl2溶液重新懸浮細胞，在冰

上放置20分鐘；

5．4℃下2500 g離心5分鐘；去上清，加入100 ml預冷0.1M CaCl2溶液在冰上使細胞重新懸浮；

6．4℃下2500 g離心5分鐘；最后一次盡量倒干凈，加入1ml預冷0.1 M CaCl2溶液重懸細胞，

50~100 ul/管分裝，液氮速凍后存于-80 ℃ 。

1、所用器具的潔凈程度：no detergents

2、培養(yǎng)基的裝量：1/10 ~ 1/5培養(yǎng)瓶容積。

3、培養(yǎng)基的pH值：接種前的pH值在6.8-7.2；菌搖好后不低于6.0。 4、培養(yǎng)后的OD值：0.4~0.6

5、培養(yǎng)溫度：較低的溫度18 ℃ ~22 ℃培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成。

6、加入DMSO保存感受態(tài)細胞。 7、液氮速凍后保存于超低溫冰箱內(nèi)。

熱激轉(zhuǎn)化

1. 取100 ml 感受態(tài)細胞，加入2-5 ul 重組DNA連接液，混勻；

2. 冰浴放置半小時；

3. 在42℃保溫 90 s；

4. 快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘；

5. 加入1 ml 新鮮SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，于37℃ 60 rpm

培養(yǎng)1小時；

6. 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。

電擊轉(zhuǎn)化

將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化

儀的樣品杯中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用

下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分

子便可進入細胞內(nèi)。

轉(zhuǎn)化效率：

Ca2+誘導轉(zhuǎn)化 10⁶ - 10⁸

/ mg DNA

電穿孔轉(zhuǎn)化 10⁸ - 10¹⁰ / mg DNA

電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備

1、 -80℃冰箱保存的菌種在SOB固體平板上劃單菌落；

2、次晨，挑選單克隆感至內(nèi)含1 ml SOB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，300 rpm，6 hr； 3、然后轉(zhuǎn)接到含400 ml SOB液體培養(yǎng)基的2L搖瓶中（按1:500的量轉(zhuǎn)接），300 rpm，

4hr，然后每隔10 min測一次OD600，至OD600=0.55； 4、立刻置冰水浴中驟冷，在冰水混合里旋動內(nèi)有培養(yǎng)物的三角瓶；

5、隨后在250 ml預冷的離心杯中離心，4℃，2000 g，10 min； 6、棄上清后，用預冷的滅菌重蒸水洗，2200 g，10 min，棄上清；

7、用預冷的10%的甘油同樣方法再洗兩次，2400 g，10 min； 8、最后一次盡量倒干凈甘油，用殘存在管底的甘油懸浮細胞，冰上分裝每100μl到

預冷過的Ep管中，液氮速凍后保存在-80℃冰箱。

每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。由于

在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，

因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞

接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體

細胞不長）。

單位： CFU（colony forming unit）

例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有

1 08個分子能進入受體細胞。一微克pUC18共有3. 4X1011個分子

（6.02X1017 / 2686X660），也就是說，每3400個pUC18分子才有一

個分子進入受體細胞。 1ng pUC18轉(zhuǎn)化100ul感受態(tài)細胞，加入900ul培養(yǎng)基復蘇1小時后取

10ul涂板，1000 colonies(=1000ng*1000 colonies*1000ul/10ul)=10⁸,

100 colonies=10⁷, 10 colonies=10⁶

轉(zhuǎn)化效率的用途

利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設計DNA重組實驗規(guī)模。例如，某一DNA重

組實驗的重組率為80%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率一般要比

天然的載體低100倍。欲獲得104個重組克隆，需投入多少載體DNA進行重組實驗？

若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個重組克隆需要：

^{104/107 X 102 = 0.1 mg 載體DNA}

考慮到實驗系統(tǒng)的重組率為80%，所以實際投入載體應為：

0.1 / 80% = 0.125 mg 載體DNA

載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按比例算出，還可以估算涂布量。

^{轉(zhuǎn)化率的影響因素
載體本身的性質(zhì)：
不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細胞，其轉(zhuǎn)化率不同。
載體的空間構象：
質(zhì)粒的超螺旋構象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于
空間構象難以恢復，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低
兩個數(shù)量級。
插入片段的大?。?/div>對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。

商品化感受態(tài)細胞
超級感受態(tài)細胞：Stratagene提供多種>5 x 109 轉(zhuǎn)化子/μg 超螺旋
DNA轉(zhuǎn)化效率的化學法超級感受態(tài)細胞，適合克隆獲得大質(zhì)粒、連接
DNA克隆和建庫時使用。
電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：Stratagene的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞耐受電擊處理，
在DNA材料極珍貴、量少時、或構建有代表性文庫時，可以采用電轉(zhuǎn)
化感受態(tài)細胞.ElectroTen-Blue細胞，是目前商品化的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)
細胞中效率最高的，達到>3 x 1010 轉(zhuǎn)化子/μg 超螺旋DNA。}