Western blotting 常見問題分析
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問題
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可能原因
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建議解決方案
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轉(zhuǎn)印膜上蛋白樣品量少
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蛋白質(zhì)上樣量不足或蛋白樣品中目的蛋白的含量低
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通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳的上樣量，保證目的蛋白的量在一抗的監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)
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轉(zhuǎn)
膜
效
率
低
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轉(zhuǎn)移緩沖液pH值與目的蛋白的等電點(diǎn)相近，蛋白質(zhì)帶所帶的電荷不足以使蛋白泳動(dòng)轉(zhuǎn)移到膜上
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調(diào)整轉(zhuǎn)移緩沖液的pH值，使目的蛋白在該環(huán)境下帶負(fù)電利于轉(zhuǎn)移
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蛋白質(zhì)變性不充分
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在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS，利于蛋白質(zhì)的變性和轉(zhuǎn)移
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轉(zhuǎn)移過程中凝膠和轉(zhuǎn)印膜之間存在氣泡，使蛋白轉(zhuǎn)移不完全
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操作中使用表面光滑的玻璃棒徹底地趕走凝膠和轉(zhuǎn)印膜之間的氣泡
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凝膠和轉(zhuǎn)印膜倆側(cè)的濾紙過大相互接觸，造成電流直接從濾紙通過，蛋白質(zhì)沒有轉(zhuǎn)移的推動(dòng)力
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將凝膠和轉(zhuǎn)印膜兩側(cè)的濾紙裁成與凝膠一般大小，對(duì)齊濾紙，轉(zhuǎn)印膜及兩側(cè)的濾紙的四邊，避免彼此長出邊緣的直接接觸
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轉(zhuǎn)印膜過期或不適合
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選用合適合格的轉(zhuǎn)印膜
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電壓或電流過大
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80-100V電壓或20mA恒流
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轉(zhuǎn)印的時(shí)間過短
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根據(jù)不同的轉(zhuǎn)移裝置保證轉(zhuǎn)移的時(shí)間
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蛋白轉(zhuǎn)移過程中環(huán)境過熱
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應(yīng)配置冷卻裝置，保證凝膠和膜處于20度以下
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顯
色
過
程
中
無
條
帶
出
現(xiàn)
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所使用的第一抗體、第二抗體及顯色方法不合適
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選擇適于目的蛋白的第一抗體；適于第一抗體的第二抗體；適于第二抗體的顯色方法
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封閉液中起封閉作用的物質(zhì)過濃
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降低其封閉作用物質(zhì)的濃度
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目的條帶含量低于一抗的檢測(cè)靈敏度
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使用合適方法增加目的條帶的含量
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一抗的效價(jià)低或稀釋倍數(shù)過大
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增加一抗的濃度即減少稀釋倍數(shù)
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二抗的效價(jià)低
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增加二抗的濃度既減少稀釋倍數(shù)
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一抗或二抗的作用時(shí)間不足
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相應(yīng)的增加作用時(shí)間，保證在37℃作用的時(shí)間在1h以上
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一抗或二抗后洗滌的時(shí)間和次數(shù)過長
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減少洗滌的次數(shù)和時(shí)間，以37℃，5~10min，三次為好，可酌情減量
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二抗的顯色時(shí)間過長（如辣根過氧化物酶）
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如果選用的是在短時(shí)間內(nèi)褪色的二抗顯色法應(yīng)注意避光顯色時(shí)間不宜太長，顯色后即拍照留圖
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顯
色
背
景
過
高
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封閉液中封閉物質(zhì)不足
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增加起封閉作用的物質(zhì)濃度
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轉(zhuǎn)印膜未能完全的被封閉液所覆蓋，膜上的非蛋白樣品的部位暴露未能被封閉物質(zhì)占據(jù)
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注意使封閉液完全的覆蓋轉(zhuǎn)印膜的每一部分
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封閉的時(shí)間和溫度不夠
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37℃下至少應(yīng)輕輕振搖封閉1h以上
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一抗為多克隆抗體，與非目的蛋白條帶也有作用
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適當(dāng)?shù)臏p少一抗的濃度和作用時(shí)間，增加洗滌次數(shù)
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二抗?jié)舛冗^高洗滌不徹底
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降低二抗?jié)舛龋m當(dāng)增加洗滌次數(shù)
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化學(xué)顯色底物過多
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按照說明適量加入顯色劑各種成分
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顯
色
時(shí)
間
過
長
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一抗或二抗?jié)舛鹊?/span>
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減少一抗及二抗的稀釋倍數(shù)或增加作用的時(shí)間
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顯色劑底物濃度不足
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增加顯色劑的用量
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顯色劑失效
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檢查相關(guān)成分的pH制和質(zhì)量
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目的條帶量少于一抗檢測(cè)的靈敏度
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濃縮目的蛋白或增加上樣用量
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蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定在化學(xué)合成膜的支撐物上，然后以特定的親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)及顯色系統(tǒng)分析此印跡。
蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)的實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)步驟：1)固定(immobilization)：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。2)封閉(blocked)：保持膜上沒有特殊抗體結(jié)合的場所，使場所處于飽和狀態(tài)，用以保護(hù)特異性抗體結(jié)合到膜上,并與蛋白質(zhì)反應(yīng)。3)初級(jí)抗體(第一抗體)是特異性的。4)第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。5)適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。
蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）
蛋白質(zhì)印跡方法是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體相應(yīng)的待檢測(cè)的蛋白質(zhì)(抗原蛋白),將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上此過程稱為blotting,以利于隨后的檢測(cè)能夠的進(jìn)行,隨后,將硝酸纖維素膜膜與抗血清一起孵育,使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合(特異大蛋白條帶),再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng),即檢測(cè)樣品的待測(cè)抗原并可對(duì)其定量。 印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 蛋白質(zhì)印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。毛細(xì)管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片硝酸纖維素膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質(zhì)并用重物壓好，緩沖液就會(huì)通過毛細(xì)作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時(shí)會(huì)將蛋白質(zhì)帶到硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水相互作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。
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