（一）、儀器設備
     醫(yī)用微波爐； 水浴鍋。

     （二）、試劑
     0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，濃HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸櫞酸鈉 88.2g，H20 定容1L。100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。雜交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L ris·Cl，0.15mol/L NaCl。BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。 

    （三）、操作流程
    1、使用地高辛標記的核酸探針進行石蠟切片的RNA原位雜交第一天
    1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
    2） 無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
    3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；
    4） PBS清洗3分鐘；
    5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
    6） PBS清洗10分鐘；
    7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分鐘；
    8） PBS清洗2次，每次3分鐘；
    9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；
    10）PBS清洗2次，每次3分鐘；
    11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
    12）PBS清洗2次，每次5分鐘；
    13）預雜交緩沖液孵育30分鐘；
    14）準備核酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；
    15）雜交；第二天
    16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；
    17）PBS清洗3分鐘；
    18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；
    19）PBS清洗5分鐘；
    20）室溫，2×SSC清洗10分鐘；
    21）37℃，1×SSC清洗10分鐘；
    22）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
    23）緩沖液A孵育10分鐘；
    24）緩沖液A（1%正常綿羊血清和0.03%三重氫核X-100）孵育30分鐘；
    25）加入抗地高辛抗體（1/200的上述緩沖液，來自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小時；
    26）緩沖液A清洗2次，每次10分鐘；
    27）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
    28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可延長到16小時；
    29）停止緩沖液B的反應，用水進行簡單的清洗；
    30）固紅，脫水以及封片進行核的復染。
    2、使用地高辛標記的寡核苷酸探針進行石蠟切片的原位DNA雜交第一天
    1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；
    2） 無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
    3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；
    4） PBS清洗5分鐘；
    5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；
    6） PBS清洗5分鐘；
    7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分鐘；
    8） PBS清洗2次，每次5分鐘；
    9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；
    10）PBS清洗2次，每次5分鐘；
    11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；
    12）PBS清洗5分鐘；
    13）預雜交緩沖液孵育30分鐘；
    14）準備寡核苷酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針；
    15）雜交；第二天
    16）將玻片置于SSC中以去除封片；
    17）室溫，2×SSC清洗10分鐘；
    18）37℃，1×SSC清洗10分鐘；
    19）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；
    20）緩沖液A孵育10分鐘；
    21）緩沖液A孵育30分鐘；
    22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時；
    23）緩沖液A清洗2次，每次5分鐘；
    24）緩沖液B清洗2次，每次5分鐘；
    25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可長到16小時；
    26）停止緩沖液B的反應，用水進行簡單的清洗；
    27）固紅，脫水以及封片進行核的復染。 

 更多相關產(chǎn)品鏈接：
  儀器庫 >> 顯微系統(tǒng) >> 倒置顯微鏡
  儀器庫 >> 影像系統(tǒng)>>專業(yè)影像系統(tǒng)
  試劑庫 >> 免疫檢測>>ELISA檢測試劑盒
  抗體庫 >> 抗體
  抗體庫 >> 第二抗體  >> 免疫組化二抗
  抗體庫 >> 試劑盒>> 免疫組化試劑盒
  儀器庫 >> 分子生物實驗儀器 >> 雜交/轉印儀器
  儀器庫 >> 分子生物實驗儀器 >> 雜交爐
  試劑庫 >>核酸檢測 >> 原位雜交