TUNEL方法（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-地高辛配基切口標(biāo)記）源自完整固定的細(xì)胞核DNA 裂解部位標(biāo)記（如Gavrieli et al. 1992)。 該法可用于組織切片、玻片上細(xì)胞生長(zhǎng)、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析，用于組織切片的改進(jìn)程序由Naik 及其合作者提出(Naik et al. 1996) ，敘述如下

1、組織切片的TUNEL 染色

1）取下組織，立即用新制備的4％甲醛固定，室溫過(guò)夜。用多聚甲醛(EM 級(jí)）制備4％的甲醛溶液，在100 ml 水中加8g 多聚甲醛，在通風(fēng)櫥中加熱至50 ~ 60℃．加幾滴1 moL/L NaOH 使固體全部溶解。 多聚甲醛全部溶解后，將溶液放冰上，迅速冷卻至室溫。加100 ml 2 的2 x PBS, 過(guò)濾固定液。甲醛儲(chǔ)存液應(yīng)在每次實(shí)驗(yàn)前新配。

2) 通過(guò)50% 、70%、80% 、95% 、100％乙醇和100% 二甲苯系列孵育（每步5 分鐘）使組織脫水

3) 用石蠟包埋組織，制備5μm厚的切片，固定于玻片上，將石蠟切片70℃加熱10分鐘或58 ~ 60℃加熱30 分鐘去除石蠟

4) 通過(guò)以下溶液進(jìn)行系列轉(zhuǎn)移水合切片：二甲苯5 分鐘2 次， 96％乙醇3 分鐘2 次，然后90% 、80% 、70% 、50 ％，雙蒸水各3 分鐘

5) 在冷的4％甲醛中后續(xù)固定切片5 分鐘，用pH7.2 的PBS 清洗3 次，每次5 分鐘

6) 室溫下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 處理玻片10 分鐘，用PBS 清洗3 次

7) 用0.5%H₂O₂的PBS 溶液室溫處理20 分鐘，封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。

8) 用補(bǔ)充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反應(yīng)緩沖液(GIBCO/BRL）預(yù)孵育切片。每個(gè)切片上加27 μl 溶液，用已裁成合適大小的Parafilm 膜覆蓋。

5x TdT 反應(yīng)緩沖液

500 mmol/L 二甲胂酸鉀， pH7.2

l0 mmol/L CoCl₂

l mmol/L DTT

9) 室溫孵育10 分鐘后，取下Parafilm 膜，用紙巾吸去水。

I0) 在用TdT 反應(yīng)緩沖液制備的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL; 15 U/ml), 2 – 4 μmol／L地高辛配基偶聯(lián)的dUTP 中孵育切片，再用Parafilm 膜覆蓋切片， 37℃ 濕室中30 分鐘～ 1 小時(shí)。用pH7.2 的PBS 將切片洗3 次。

11) 用5 U/ml 辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛孵育玻片，用Parafilm 膜覆蓋。37℃ 溫室中孵育30 分鐘

l2) 應(yīng)用快速DAB 底物(Sigma) ，用DAB 和H₂O₂ 處理檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞。用過(guò)量水清洗切片。可用甲基綠復(fù)染切片30 秒。用過(guò)量水清洗。

13) 通過(guò)用二甲苯終洗2 次的系列乙醇使切片脫水。 用Permount 或Entallan介質(zhì)固定，用光學(xué)顯微鏡分析

注意事項(xiàng)

TUNEL 陽(yáng)性核被染成深棕色。如需要，在DAB 反應(yīng)中可加人硫酸鎳(3 mg/ml) 。可以增強(qiáng)染色，陽(yáng)性核將呈現(xiàn)紫／黑色。

1. TUNEL 染色的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析

1) 凋亡誘導(dǎo)之后， 200 g 離心5 分鐘收集1×10⁶ 懸浮細(xì)胞，用冷的PBS 洗2次，重復(fù)離心

2) 用2 ml 2 ％的甲醛PBS 溶液(pH7.2，用多聚甲醛新配）固定細(xì)胞沉淀，室溫下在水平搖床上孵育30 分鐘。

3) 200 g 離心5 分鐘沉淀細(xì)胞，用PBS 洗1 次。重復(fù)離心。

4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 ％檸檬酸鈉溶液4℃ 孵育2 分鐘透化細(xì)胞，用PBS 洗2次。

5) 在溫室中于TdT 緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二鉀胂酸鈉）中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl₂、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小時(shí)，進(jìn)行TUNEL 反應(yīng)，終體積50 μl

6) 37℃孵育1 小時(shí)后，加人2μl 0.5 mol/L EDTA 終止反應(yīng)，用pH7.2 的PBS 將細(xì)胞洗2次。用帶有氬激光(488 run) 的流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(FACScan, Becton Dickinson) 分析數(shù)據(jù)?；蛘撸蓪⒓?xì)胞重懸于50μl 液體固定介質(zhì)如FluoroGuard (Bio-Rad) 中，移到載玻片上，蓋上蓋玻片、用熒光顯微鏡分析。

注意事項(xiàng)

FACSsean 對(duì)TUNEL 標(biāo)記的定量分析最好用于淋巴細(xì)胞，對(duì)貼壁細(xì)胞如成纖維細(xì)胞效果不夠好

1. 貼壁細(xì)胞的TUNEL 染色

1) 用無(wú)菌鑷子將一無(wú)菌蓋玻片放入35 mm 培養(yǎng)皿中

2) 將大約1×10⁴ 細(xì)胞接種于無(wú)菌蓋玻片上，培養(yǎng)24 ~ 48 小時(shí)。凋亡誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞鋪滿不超過(guò)80% ，如細(xì)胞貼壁不太好，可以用纖連蛋自、聚賴氨酸或血清預(yù)處理蓋玻片，以使細(xì)胞更好地貼壁生長(zhǎng)

3) 誘導(dǎo)凋亡后，用pH7.2 的PBS 輕輕洗細(xì)胞1 次，不要除去垂死細(xì)胞，用冰冷的甲醇（- 20℃） 固定10 分鐘

4) 室溫空氣干燥玻片5 分鐘，在pH7.2 的PBS 中溫育10 分鐘重新水合

5) 按上述方法進(jìn)行TUNEL 反應(yīng)。將合適的Parafilm 膜放入溫室，膜上加50μl TdT反應(yīng)混合液，放蓋玻片，細(xì)胞朝下在反應(yīng)液上。37℃ 孵育1 小時(shí)

6) 從溫室中取出蓋玻片，放回35 mm 培養(yǎng)皿中。用PBS 洗細(xì)胞3 次，用固定液(Bio-Rad) 固定到載玻片上