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豬丁型冠狀病毒又稱豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV），是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，它主要感染整段小腸，尤其是空腸和回腸，引起嚴重的腸炎并伴有小豬的腹瀉和嘔吐。2009—2010 年P(guān)DCoV 在中國香港首次報道該病毒。2014 年初，在美國首次報道豬群該病的流行，此后至少有19 個州有該新型冠狀病毒的報道。在美國，豬丁型冠狀病毒感染與豬流行性腹瀉（PED）和豬傳染性胃腸炎（TGE）的臨床發(fā)病情況比較相似，但是發(fā)病癥狀相對較輕。新型豬腸道冠狀病毒病可引起乳豬腹瀉和嘔吐，發(fā)病率和死亡率高達50% ～ 100%，生長豬和成年豬感染后死亡率低?，F(xiàn)將本次病例報告如下。

1、材料與方法

1.1 病料

來自華南某集約化豬場（2 000 頭基礎(chǔ)母豬）3 ～ 7 日齡的乳豬5 頭，全場乳豬發(fā)生嚴重腹瀉，傳播迅速，發(fā)病率90%、死淘率90% 以上。采集發(fā)病豬的小腸，按1：5研磨制備成病料，-80 ℃凍存待檢。

1.2 主要試劑

RNA 抽提試劑盒購于上海百賽生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、18T 載體克隆試劑盒、DL2000DNA Marker、膠回收試劑盒、DH5α 感受態(tài)細胞等購自TAKARA公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

本實驗室根據(jù)GenBank所發(fā)布的序列號，選擇N 基因，運用PrimerPremier5.0 分別針對PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV（豬輪狀病毒）設(shè)計4 對引物，由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)計擴增的特異性基因片段大小為482 bp、450 bp、810 bp和620 bp。

1.4 總RNA 的提取

病料經(jīng)離心取上清液，按照ANYGEN 核酸提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，然后用物RNA 酶的水溶解，放在-80℃保存。

1.5 RT-PCR 的檢測

反轉(zhuǎn)錄體系：ddH2O4 μL，下游引物R 1μL，RNA1μL，70 ℃水浴10 min 冰浴2 min；5×MLV buffer 2μL，ddH2O 1μL，dNTPs 0.5μL，RNA 酶抑制劑0.25μL，MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.25μL，42 ℃水浴1 h，72 ℃水浴15 min冰浴至冷卻。PCR 體系：ddH2O 32.5μL，10×MLV buffer 5μL，dNTPs 4μL，F(xiàn) 2μL，R2μL， cDNA 4μL，rTaq 0.5μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30Cycles ，72 ℃ 7 min，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物于1.0% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 克隆

將陽性PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與PMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后挑單個菌落進行PCR 鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒送往睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.7 序列分析

將RT-PCR擴增獲得的N 基因進行克隆、測序， 利用MEGA6 軟件處理，與GenBank 上已公布的PDCoV 毒株的N 基因序列（表1）進行同源性比對分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。

2、結(jié)果與分析

2.1 病豬癥狀和病變

該集約化豬場5至15 日齡乳豬發(fā)生傳播迅速的嚴重腹瀉，迅脫水死亡，死淘率高達90% 以上。癥狀見剖檢病變見圖1 和圖2。主要在小腸,腸管明顯擴張, 內(nèi)充滿黃色液體, 腸壁變薄、松弛、小腸黏膜充血, 腸系膜呈索狀充血。

2.2 4種病毒N基因擴增

應(yīng)用RT-PCR方法對樣品進行了PEDV/TGEV/RV/PDCoV 檢測，結(jié)果顯示PEDV/TGEV/RTV 未能擴增出目的條帶，而PDCoV 擴增出與預(yù)期大小一致片段，約482 bp，電泳圖見圖3。檢測結(jié)果顯示該病料PEDV/TGEV/RTV 為陰性，PDCoV 為強陽性，說明該豬場可能存在PDCoV 的感染。

2.3 PDCoV N基因序列分析

由測序結(jié)果可知，Ch-A測序的N 基因中間存在一個核苷酸的缺失、幾個突變。運用DNAstard 軟件將測序正確PDCoV N 基因序列與GenBank 上已發(fā)表的國內(nèi)外毒株N 基因參考序列進行同源性比對分析，結(jié)果顯示獲得PDCoV 毒株N 基因之間的核苷酸序列同源性為98.3% 到100%，氨基酸序列同源性為95.0% 到100% ；其中TX 與中國已公布毒株相比核苷酸同源性為98.3% 到99.0%，氨基酸同源性為95.0%到96.9%，顯示與中國香港毒株HKU15-155 同源性最低；與韓國和美國毒株相比核苷酸同源性為98.8%-99.0%，氨基酸同源性為96.2% 到96.9%（結(jié)果見圖4、圖5）。

2.4 PDCoV N 基因遺傳進化分析

運用MEGA 6.06軟件繪制N 基因系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明我國新出現(xiàn)的豬丁型冠狀病毒（Ch-A）與國內(nèi)外報道的豬丁型冠狀病毒親緣關(guān)系較遠，它單獨在一個新的分支上。說明這是在我國新發(fā)現(xiàn)的一個新毒株（結(jié)果見圖6）。

3、討論

自2013 年至今，新出現(xiàn)的PEDV 和PDCoV 已遍布美國，造成大量豬死亡。目前國際上正在形成該病毒相關(guān)研究熱點，也發(fā)表了少量的報告。但國內(nèi)至今未見該病毒為主因在豬場暴發(fā)和流行的報道。

我們首次報道了國內(nèi)集約化豬場暴發(fā)豬丁型冠狀病毒病。通過設(shè)計4 對冠狀病毒引物，在檢測PEDV、TGEV和RTV為陰性后，進一步設(shè)計引物擴增PDCoV，顯示為強陽性。對PDCoV HN 株的N 基因進行測序，并與國內(nèi)外已公布的序列進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示：該PDCoV 毒株（Ch-A）與GenBank上公布的美國株及中國株不在一個分支上，是新發(fā)現(xiàn)的一株新型冠狀病毒病。該分支的毒株是否與本次發(fā)病的高致病力有關(guān)值得深入研究。仍然未知該病毒是怎么傳入我國及其在我國各地的感染情況。

老病未消除、新病涌現(xiàn)，需高度重視和立即加強研究對豬丁型冠狀病毒的監(jiān)測和系統(tǒng)性研究，降低給養(yǎng)豬業(yè)帶來的損失和威脅。（資料來源：賀東生等,豬業(yè)科學(xué)2015(10), P76-77）