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專利名稱促進糖發(fā)酵速率的酵母新菌株這些菌株的獲得方法及其應用的制作方法 技術領域本發(fā)明涉及能改進糖類發(fā)酵的酵母新菌株、構建這些酵母的方法和這些改進后酵母的使用。 眾所周知酵母菌株屬于酵母菌屬(Saccharomyces)，在厭氧條件下，酵母菌株能發(fā)酵糖類產生摩爾量相等的CO2和乙醇，酵母在面團中的發(fā)酵活性即為該發(fā)酵的結果，商業(yè)產品面包酵母以濃縮酵母或新鮮酵母和干燥酵母等數(shù)種形式出現(xiàn)，干燥酵母易制成活性干燥酵母和速時干燥酵母，它們分別含有6～8%和3～6%的水份。 酵母中糖代謝的最早步驟為糖分子穿過質膜，在酵母中對于不同的糖類有特異載體表達。例如，麥芽糖的攝入依賴于特異的麥芽糖滲透酶的存在。該載體有兩種形式，兩者的區(qū)別在于其最大速度(Vmax)和親和常數(shù)(Km)不同(A.BusturiaandR.Lagunas，Biochim.Biophys.Acta820，324(1985))。麥芽糖穿過酵母質膜的運輸是與該膜上的電化學質子梯度相偶聯(lián)的，每一個麥芽糖分子伴隨著一個質子進行同向易位(R.Serrano，Eur.J.Biochem.80，97(1977))。 在細胞內，通過麥芽糖酶(α-葡糖苷酶)催化反應，將麥芽糖水解為兩個葡萄糖分子。接著通過Embden-meyerhof途徑，葡萄糖再轉化為二氧化碳和乙醇。與發(fā)酵葡萄糖相比較，發(fā)酵麥芽糖還需另外兩種酶麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶，麥芽糖誘導這些酶的合成，而葡萄糖、果糖或甘露糖則起抑制作用。在非糖化(“精的”)的面團中，麥芽糖是酵母易得到的最豐富的糖。在面團中加入蔗糖時，該二糖則在細胞外由酵母水解成葡萄糖和果糖。然后由獨特的滲透酶作用，這些己糖被酵母攝入。 通常發(fā)現(xiàn)，在含麥芽糖的面團中加入蔗糖抑制酵母細胞對麥芽糖的代謝作用，這是由于編碼麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶的基因轉錄受到了葡萄糖的抑制(R.B.Needleman，D.B.Kabace，R.A.Dubin，E.L.Perkins，N.G.Rosenberg，K.A.Sutherland，D.B.ForrestandC.A.Michels，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，2811(1984))。 攝入和水解麥芽糖所必須的基因聚集在MAL位點上(R.B.Needlemanetal.Supra)。酵母菌屬的菌株可含有多至5個MAL位點(MAL1-4和MAL6)，這些位點不是連接在一起的，而是位于不同染色體的頂枝上(J.L.CelenzaandM.CarlsonGenetics109，661-664(1985))。一個MAL位點包含有編碼麥芽糖滲透酶、麥芽糖酶和一種或幾種麥芽糖誘導所需的調節(jié)蛋白(MAL調節(jié)子)的基因(R.B.Needlemanetal.Supra;J.D.Cohen，M.J.Goldenthal，T.Chow，B.BuchfererandJ.Marmur，Mol.gen.Genet.200，1(1985);R.A.Dubin，E.L.Perkins，R.B.NeedlemanandC.A.Michels，Mol.Cell.Biol.6，2757(1986))。所述的基因已被分離和克隆(A.O.J.D.Cohenetal.Supra;R.B.Needlemanetal.，Supra;H.J.Federoff，J.D.Cohen，T.R.Eccleshall，R.B.Needleman，B.A.Buchferer，J.GiacaloneandJ.Marmur，J.Bacteriol.149，1064(1982))。 正如上面所述的，在精面團中的酵母發(fā)酵依賴于麥芽糖作為主要底物。通過淀粉酶(通常存在于面粉中)的作用，由面團中的淀粉可產生麥芽糖。另外，在面粉中還含有不等量(0～0.5%)的游離糖類象葡萄糖、棉子糖等(H.Suomalainen，J.DettwilerandE.Sinda，ProcessBiochem.7，16(1972))。這些糖很快地被酵母消耗掉。一些研究報道了麥芽糖發(fā)酵和面包酵母本身的發(fā)酵活性之間的相關可能性。一些例子表明麥芽糖發(fā)酵速度和麥芽糖酶及麥芽糖滲透酶的活性正相關，然而，沒有發(fā)現(xiàn)精面團中的發(fā)酵活性與麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶的活性有正相關(P.HauteraandT.Loevgren，J.Inst.Brew.81，Microbiol.4，37(1977))。 在含有編碼麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶基因的多拷貝質粒轉化的酵母細胞中，麥芽糖酶的特異活性增加四倍，而麥芽糖滲透酶的活性沒有增加。導入編碼調節(jié)蛋白的外源基因后，麥芽糖酶的特異活性有適度增加，但還是看不到對麥芽糖滲透酶活性有任何影響(J.D.Cohenetal.Supra)。這些研究者沒有對所獲轉化體產生的二氧化碳和乙醇進行測定。事實上現(xiàn)有技術不主張進行這種試驗，因為在精面團中，麥芽糖滲透酶的活性與二氧化碳產物(發(fā)酵活性)毫不相關，這些已得到反復的證明(H.Suomalainen，JDettwilerandE.Sinda，Supra;H.Suomalainen，Eur.J.Appl.Microbiol.1，1(1975);P.HauteraandT.Loevgren，Supra;T.LoevgrenandP.Hautera，Supra)。 我們已經(jīng)找到了由下面將要描述的完整質粒轉化的酵母，與沒有轉化的相比，它能提高麥芽糖滲透酶和麥芽糖活性水平。令人驚呀的是麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶活性的提高與CO2產量或發(fā)酵活性的增加是一致的，同樣，在由附加載體轉化的酵母中可以看到同樣的現(xiàn)象。 這些改進酵母顯示了較高的代謝速度，因而從含糖(如麥芽糖作為主要碳源和能源)的培養(yǎng)基中獲得較高的二氧化碳和乙醇的產量。本發(fā)明提供的方法涉及重組DNA技術在不受象葡萄糖這樣的糖類抑制的大大提高麥芽糖發(fā)酵速率所述酵母中的應用。 另外，這些改進的酵母菌株在面團中顯示了良好的發(fā)酵活性(氣體產量)。類似地，在較短的發(fā)酵時間里，這些酵母產生乙醇的速率較快，這些乙醇可作為飲用產品和工業(yè)酒精，或者在一定時間內可產生較大量的酒精。 另外，在麥芽糖(積累)抑制轉化糖或淀粉的酶時，對于發(fā)酵方法來說，迅速除去麥芽糖是具備優(yōu)越性的。通過本發(fā)明的方法可得到導入編碼麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶的外源基因的酵母。 本發(fā)明提供了一種改進糖發(fā)酵速度的轉化酵母及其生產方法，其中包括至少有一個優(yōu)選同源的含有至少一個編碼促進轉移底物攝入和/或代謝轉化起始蛋白基因的DNA構建導入酵母體內，并能在其中表達。在發(fā)酵的幾個階段可以加快糖發(fā)酵速率，例如由于發(fā)酵麥芽糖或蔗糖而引起速率提高。 同源DNA則表示來源于同一個酵母屬，如酵母菌屬用來源于酵母菌屬的DNA進行轉化。這種方能夠改進該酵母屬的已具備特征，而不必導入該屬的以前沒有的新特性。在有氧和/或厭氧條件下，可改進糖發(fā)酵速率。為完成本發(fā)明目的基因包括滲透酶(尤其是麥芽糖滲透酶)、糖酶(尤其為麥芽糖酶)、激酶(尤其是己糖激酶和葡萄糖激酶)等等的基因。本發(fā)明可能使用的有一個攝入葡萄糖或果糖所需的運載蛋白和催化己糖(使其在細胞內起始代謝轉化)為己糖磷酸酯的己糖激酶和葡萄糖激酶。 本發(fā)明還提供了將至少一個同源DNA構建物導入酵母的有效方法。 對本發(fā)明有益的采用的一個構建物至少包括一個編碼促進麥芽糖攝入和麥芽糖起始代謝轉化為葡萄糖的基因。用這種方法可以得到較原始(受體)菌種有許多優(yōu)越性的酵母。改進后酵母的優(yōu)點在于增加了乙醇和CO2的產量。例如當本發(fā)明應用于面包酵母，對于面包師來說將產生巨大的優(yōu)越性，因為由于新菌株改進的發(fā)酵活性使得面包師僅需較少的時間或酵母即可獲得精面團。 本發(fā)明的轉化菌株將進一步增加，它可作為非DNA轉化作用的改進方法的起源菌株，如細胞質融合、群體雜交和突出，所得菌株視為本發(fā)明的一個部分。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，在有葡萄糖存在的條件下，新菌株將消耗大量的麥芽糖。所以面包師還可省下糖的費用，因為獲得甜面團僅需加很少的糖。 眾所周知滲透性酵母在精面團中的發(fā)酵活性是很低的。采用滲透性酵母目的在于其在甜面團中有較好的發(fā)酵活性。在制甜面包的面團中含有10～30%的糖(基于面粉重量)。因此，根據(jù)本發(fā)明選擇滲透性菌株作為受體，得到的滲透性酵母不僅可用于甜面團，而且可用于精面團，因為它發(fā)酵麥芽糖的能力用本發(fā)明的方法得以改進。于是面包師可以很方便地只需要一種酵母用于甜面團和精面團。 對于既能在精面團又能在甜面團中有較好發(fā)酵活性的酵母菌株的要求在EP-A-128524和DE-A-2757778中已有描述。為了獲得在富含糖和精面團中均發(fā)揮較好作用的酵母菌株，EP-A-128525描述了質體融合方法DE-A-2757778描述通過雜交或突變方法制備的二倍體菌株選擇這種菌株的方法。兩種方法均需許多實驗，而且結果不能預測和重復。利用本發(fā)明的方法，得到轉化酵母菌株是可以控制和重復的。按照本發(fā)明生產的菌種，試驗最少，因為除了公開的改進菌株特性外，菌株本身的特性實際上是不能改變的。 本發(fā)明提供了一種濃縮酵母，在試驗B中，在165分鐘內每285mg干基酵母產生至少340ml氣體。在試驗B′中為每285mg干基酵母產生至少170ml氣體。試驗B和B′在后面描述。優(yōu)選的濃縮酵母在試驗B中，于165分鐘內，氣體產量為380～450ml/285mg干基酵母，試驗B′中氣體產量為180～240ml/285mg干基酵母，在最佳的試驗B和B′中氣體產量分別為400ml/285mg和190ml/285mg干基酵母。從該濃縮酵母有益地制備速時干燥或活性干燥酵母。在濃縮酵母的干燥期內，基于干基的15～25%的發(fā)酵活性逐漸丟失。本發(fā)明還提供了一種干燥酵母(3～8wt%的水份)，它在試驗C中氣體產量為310～360ml/285mg干基酵母(時間為165分鐘)，在試驗C′中為145～195ml/285mg干基酵母，優(yōu)選的干燥酵母在試驗C和C′中氣體產量分別為330ml/285mg干基酵母和155ml/285mg干基酵母。根據(jù)本發(fā)明制備的酵母所產生的氣體值，當用能買到的菌株進行試驗C和C′時是達不到的。本發(fā)明得到的酵母還能在含0～6或0～10%糖的面團中顯示較好的發(fā)酵活性。以這種方式可以制備濃縮酵母，其在試驗B中，165分鐘內，氣體產量為400～500ml/285mg干基酵母，優(yōu)選的濃縮酵母產生氣體至少為440ml/285mg干基酵母。然后得到干燥酵母，在試驗C中，165分鐘內產生氣體320～400ml/285mg干基酵母，優(yōu)選的產生氣體至少為350ml/285mg干基酵母。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些新菌株在發(fā)酵食用產品和工業(yè)酒精時的優(yōu)點是相似的。 因為當麥芽糖作為底物時，這些新菌株的總代謝速度已有增加，于是代謝物如甘油和芳香化合物的產生總速度也增加。 本發(fā)明的另一個方面為提供了攜帶編碼一種或多種涉及麥芽糖發(fā)酵蛋白的DNA構成物載體。本發(fā)明還提供了一個微生物受體，優(yōu)選的一種酵母，它屬酵母菌屬，用本發(fā)明公開的載體轉化。這些載體可以自我復制和有益地含有選自編碼麥芽糖滲透酶、麥芽糖酶和麥芽糖調節(jié)蛋白基團的一個基因或幾個基因的組合。意想不到地發(fā)現(xiàn)用這些載體轉化的酵母-加速麥芽糖發(fā)酵，在面團中的CO2生成速度也增大。然而這些外加基因位于游離體，從參考文獻中可知，在無選擇繁殖期間這些外源染色體分子易丟失(如特例在G418缺失的條件下生長)(C.D.Holleuberg(1982)Gene Cloning 12，Organisms Other than E.Coli，Eds.P.H.Hofschneider，W.Goebel，Springer Verlag，119;S.A.parent，C.M.Fenimone，and K.A.Bostian(1985)，Yeast1，83)。從實用觀點來看，有益地構建一套完整的含有麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因(優(yōu)選改變的)的質粒，這里的“改變”是指用另一個啟動子(優(yōu)選系用同源的)與自然啟動子交換。這里發(fā)展了在無選擇壓力的條件下，使得質粒穩(wěn)定地繁延的方法，為了得到穩(wěn)定的轉化體，新導入DNA的整合不再是先決條件。 從文獻中了解到一個含有20～100個分子組成的外源質粒的細胞(C.D.Hollenberg(1982)，Supra;A.Takagi，E.N.Chun，C.Boorchird，S.HarashimaandY.Oshima，Appl.Microbiol.Biotechnol.23，123;J.Mellor，M.J.Dobson，N.A.Roberts，N.J.KingsmanandS.M.Kingusman(1985)Gene33，215)。 用外來啟動子替換原始啟動子，可以進一步提高游離基因的表達水平。這似乎在以后沒有選擇壓力存在的條件下，質粒的穩(wěn)定復制成為可能。 根據(jù)本發(fā)明的方法，麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因通過線性質粒的轉化有益地整合到酵母染色體中(參見T.L.Crr-Weaver，J.W.Szostak，R.Rothstein(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6354)。所得到的酵母是穩(wěn)定的轉化體，即在既使無選擇壓力的條件下，改變的麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因可保持在基因組內。 整合時只有質粒上的一個或幾個基因拷貝整合入染色體。因此，為了得到象采用游離載體時改進CO2產量那樣的效果，采用對葡萄糖抑制不敏感的良好組成啟動子可有益地改變基因表達水平。為了補償用游離和整合載體轉化酵母之間的基因拷貝數(shù)區(qū)別和防止葡萄糖阻遏的作用，這些啟動子是優(yōu)選的。例如，據(jù)觀察在含有麥芽糖作為主要碳源和能源及相對低濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中，發(fā)酵的最初30～40分鐘內，麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶的mRNA水平下降至幾乎不可檢測的水平，一旦葡萄糖消耗完畢，麥芽糖對基因表達的誘導作用使得兩種mRNA水平迅速升高。 可以使用自然的或野生型啟動子或可由不同啟動子取代的啟動子基因，優(yōu)選的是一個同源啟動子。尤其，野生型啟動子是可調節(jié)的或可誘導的，它能提供結構轉錄、或者是一較強或較弱啟動子。相反地、野生型啟動子為結構的啟動子，它能提供一個可調節(jié)或可誘導啟動子或一個較強或較弱的啟動子。 按照需要使用強啟動子，尤其是當受體中構建物拷貝數(shù)相對的低時。強啟動子通常涉及在酵母生活周期中使蛋白產率處于較高水平或者是可調節(jié)的為完成本發(fā)明任務，在酵母生活周期中的某一階段發(fā)揮作用。 與酵母的糖酵解過程相聯(lián)系的啟動子包括乙醇脫氫酶Ⅰ和Ⅱ，磷酸葡萄糖異構酶、葡萄糖磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、甘油醛磷酸脫氫酶、磷酸甘油激酶、烯醇化酶、磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的啟動子。其它涉及高產量蛋白質的啟動子包括核糖體的表達，象起始因子、延長因子等轉錄的啟動子。尤其是包括EF-1和EF-2等的延長因子啟動子。 為了完成本發(fā)明任務，與結構基因組合的啟動子的使用涉及麥芽糖代謝，尤其是麥芽糖酶、麥芽糖滲透酶和MAL調節(jié)子。這些啟動子可以是結構區(qū)或調節(jié)區(qū)，只要在糖發(fā)酵期間可以誘導啟動子。例如，糖酵解的許多啟動子可由糖或糖代謝物如乙醇激活。于是，象乙醇脫氫酶這樣的啟動子在面粉發(fā)酵期間顯示活性。同樣與細胞再育相關的那些啟動子在面粉發(fā)酵期內也顯示活性。另外，提供的啟動子不受MAL調節(jié)子的調節(jié)，也不受葡萄糖的阻遏，還有基因不需麥芽糖誘導。 將野生型啟動子與完成本發(fā)明任務的結構基因連接，可預想使得一個調節(jié)蛋白的產量有所提高。以這種方式，有誘導物存在時，調節(jié)蛋白可保持在較高水平。例如麥芽糖可使得MAL調節(jié)蛋白表達處于高水平，這樣使得與麥芽糖代謝相關的其它蛋白得以表達，并受MAL調節(jié)蛋白調節(jié)。 如實驗程序中詳細描述的基因表達中的改變包括原始啟動子加工(部分)不轉譯的乙醇脫氫酶Ⅰ(ADHI)的引導順序與轉譯延長因子EFlαA(優(yōu)選取自受體酵母，如酵母菌屬)的交換。所以，表達與葡萄糖的阻遏無關和不取決于麥芽糖的誘導。 由這些整合的質粒轉化的酵母與沒有轉化的菌株相比其麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶活性水平得以提高。在用游離載體轉化的酵母中，出乎預料地發(fā)現(xiàn)增強麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶活性與CO2產量或發(fā)酵活性增加相一致。 在貯存期間甚至提高溫度如20～25℃，保持了獲得的改進的發(fā)酵活性。貯存期間發(fā)酵活性的相對丟失最終與親代菌株和本發(fā)明的菌株相一致。富含糖的面團中的發(fā)酵活性不受導入的變體的影響，因為用整合質粒轉化的新菌株的發(fā)酵活性是與獲得這些菌株的受體菌株的發(fā)酵活性一樣的。 完成本發(fā)明任務的酵母受體中至少含有一構建物的拷貝，可能有兩個或多個拷貝，通常不超出約200個，這些取決于基因是否被整合進基因組，是否擴增，或有無多拷貝的外源染色體成分。根據(jù)保持制備的外源染色體成分的穩(wěn)定性需要、預期的拷貝數(shù)、取決于拷貝數(shù)可進行的轉錄水平等等，可決定是否整合。 構建物可以包含一個或多結構基因和同一或不同的啟動子。用常規(guī)方法可制備構建物，如從合適受體中分離所需要因，人工合成基因的全部或部分片段，或為它們的組合。同樣，通過從自然庫中分離，人工合成，或它們的組合方法可以得到調節(jié)信號、轉錄和轉譯的起始及終止區(qū)域。各種片段可受到內切酶消化(限制性)、再連接、序列測定、體外誘變、引物修復、或類似過程。各種操作在文獻中是已知的，可用來完成特定的目的。 用常規(guī)方法對各種片段進行組合、克隆、分離和序列分析。每次操作后，將DNA片段或這些片段的組合插入克隆載體、該載體轉化入一個克隆受體中(如大腸桿菌(E.Coli))，培養(yǎng)、溶解克隆受體，分離質粒和限制性分析法分析片段，進行序列測定，或它們的組合，或類似方法。 在發(fā)展構建物和受體細胞轉化的過程中，采用了各種載體，這些載體有克隆載體、表達載體，和用來整合入受體的載體或使用用于轉化和整合作用的裸露DNA。 克隆載體(最重要部分)的特點為在克隆受體中有復制起點功能，有一個選自含有克隆載體受體的標記，可能有一個或幾個多聚銜接物，或者適于插入，選擇，操作，易測定序列、切割等的附加序列。另外，可采用閘載體，該載體有兩個或更多個的復制起點，使得該載體能在多子一個受體中復制，例一個原始受體和一個真核受體。 表達載體通常有一個構建物插入，該構建物含有轉錄和轉譯起始和終止區(qū)域或缺少一個或兩個這些調節(jié)區(qū)域，這些區(qū)域則由表達載體上編碼蛋白質產物的插入序列提供。于是，構建物可插入含有轉錄和轉譯功能區(qū)域的基因中，在5′端插入或切割基因，將構建物插入現(xiàn)有調節(jié)區(qū)域能夠調節(jié)控制的區(qū)域中，通常期望起始密碼在原有起始密碼的5′端，除非一個融合產品可以接受，或起始密碼超出了原始起始密碼的范圍。在另外一些例子中，表達載體在起始和終止調節(jié)區(qū)域之間有一個或多個限制位點，于是結構基因可在限制位點插入，且受這些區(qū)域的調節(jié)控制。為了完成本發(fā)明任務的用于表達的載體(無論用于外源染色體穩(wěn)定性保持或整合)，受體內穩(wěn)定的構建物和載體是不含外源(非酵母菌屬)DNA的。 根據(jù)本發(fā)明方法的進一步特征生產具備上述描述的所有優(yōu)越性的酵母，而且還去除原核細胞DNA序列，這過程用基因置換技術完成(R.J.Rothstein(1983)MethodsinEnzymology，101，202)。本發(fā)明的這些技術現(xiàn)在被有益地應用于酵母菌屬細胞。例如，用含有位于酵母菌屬孢子形成特異性基因內編碼改變麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因的載體轉化酵母菌屬細胞(E.Gottlin-Ninga，D.B.Kaback(1986)Mol.Cell.Biol.6，2185)。當該DNA導入酵母菌屬受體細胞后，新導入的DNA和染色體孢子形成特異性基因進行同源重組。結果，嵌入孢子形成特異性序列的改變麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因被整合到染色體中。所得轉化體根本沒有原核DNA。 假如測定到麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶活性的滿意速率，甚至更好的結果，那么這是令人滿意的。通過改變啟動子的兩個基因或將不同數(shù)量的(改變的)麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶基因整合到酵母基因組內(例如根據(jù)下面描述的方法，采用幾個整合位點)，可以得到上面的結果。采用編碼麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶的其它同Ⅰ酶的麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶的滿意速率。另外，只要具有麥芽糖酶或麥芽糖滲透酶活性的酶基因可以采用。另外，采用類似方法能將編碼MAL調節(jié)蛋白的基因整合到基因組中(參見例1)，該基因可由自己本身的自然啟動子控制，也可以由另外一個啟動子(優(yōu)選的為酵母菌屬)控制。這對獲得麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶活性的滿意速率也是有用的。 已寄存菌株下列菌株已寄存在CentraalBureauVoorSchimmelcultures，Baarn，Holland酒酵母(Saccharomycescereuisial)237Ng(菌株A)于1986年3月25日在CBS寄存，登記號為158.86。 酒酵母(Saccharomycescerevisiae)DS15543(菌株C)于1987年9月3日在CBS寄存，登記號為406.87。 包含有質粒p21-40的大腸桿菌(EscherichiaColi)于1987年8月28日在CBS寄存，登記號為400.87。 含質粒pYEF46的大腸桿菌子1987年8月28日已在CBS寄存，登記號為401.87。 含質粒pY6的大腸桿菌于1987年8月28日已在CBS寄存，登記號為402.87。 含質粒peG418的大腸桿菌于1987年3月25日已寄存在CBS，登記號為160.86。 含質粒pTZ19R的大腸桿菌于1987年9月3日已在CBS寄存，登記號為405.87。 含質粒pTZ19R/ADHI的大腸桿菌于1987年9月3日在CBS寄存，登記號為404.87。 含質粒p153-215AK的大腸桿菌于1987年9月3日已在CBS寄存，登記號為403.87。 含質粒pLF24的大腸桿菌于1988年3月8日已在CBS寄存，登記號為156.88。 含質粒pUT332的大腸桿菌于1988年3月8日已在CBS寄存，登記號為158.88。 含質粒pTZ18R的大腸桿菌于1988年7月27日已在CBS寄存，登記號為480.88。 圖解說明附圖說明  圖1描述了質粒pGb-eMAL69的構建，箭頭表示所指基因的轉錄方向，質粒是簡圖而不是詳細結構?？s寫G418，對G418有對照抗性的Tn5基因(由ADHI啟動子控制);P，PvuⅠ;X，XbaⅠ;S，SalⅠ;H.HindⅢ;CIP小牛腸道磷酸酶。 圖2描述了質粒pGb-eMAL61的構建，質粒只是以簡圖表示而不是詳細結構。縮寫△麥芽糖酶的部分缺失基因;B，BgⅡ。參見圖1的說明。 圖3描述了質粒pGb-eMAL63的構建，質粒以簡圖表示而不是詳細結構。縮寫(K)，填入KpnⅠ位點;(S)，填入SaⅡ位點;Klewouw，DNA聚合酶大亞基;H.HindⅢ。還有參見圖1說明。 圖4表示pGb-M6g(△-9)的構建，縮寫H，HindⅢSt，StuⅠ;Klenow，DNA聚合酶Ⅰ的大片段;EV，EcoRⅤ;Xh，XhoⅠ;M，MluⅠ;flori，噬菌體fl的復制起始點;amp氨芐青霉素抗性基因;S.P.序列引物。箭頭表示5′→3′方向。缺失區(qū)域由點線和△表示。 圖5表示質粒pGb-M6g(△-9)序列。 a)麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶基因，箭頭表示轉錄方向。St(StuⅠ)作為構建缺失突變的起點，基因間區(qū)域的相關部分在該圖的下部表示。 b)pGb-m6g(△-9)序列，缺失區(qū)域從-9至-417。多聚銜接物表示寡聚核苷酸，它已連接在Ba131處理過的DNA上(還可參見圖4)。 圖6描述質粒pGb-iA32/G418的構建。箭頭表示轉錄方向，質粒是示意地繪出沒有按照比例。縮寫H，HindⅢ;EV，EcoRⅤ;flori噬菌體fl的復制起始位點;amp氨芐青霉素抗性基因;G418，對G418有對照抗性的Tn5基因(啟動子為ADHI);S，SmaⅠ;Hc，HincⅡ，pADHⅠ，醇脫氫酶Ⅰ基因啟動子十部分5′引導(鑲接區(qū)域)。 圖7表示質粒pGb-iRRol的構建。 a)質粒沒有按照比例繪出?？s寫E，EcoRⅠ;B/Bg，BamHⅠ/BglⅡ連接;H，HindⅢ。 b)誘變pT4，將EFlαA啟動子+5′引導與麥芽糖酶基的5個N端氨基酸的密碼融合，這還產生一個BglⅡ位點，顯示了相關序列。 誘變引子與EFlαA序列部分互補(用點表示)，不配對區(qū)域為麥芽糖酶密碼和方框中BglⅡ的識別位點(注這里誘變引子的方向為3′→5′，即BglⅡ位點應從右向左閱讀(5′→3′)。 標出了麥芽糖酶序列的N端的5個氨基酸密碼子。BcⅡ識別位點在框內。 在pT4-M序列中標出了涉及突變的序列。BglⅡ位點在方框內。星號表示麥芽糖酶苷酸序列的偏差，在第4個密碼上的偏差是靜止突變。 c)質粒沒有按照比例畫出。縮寫H，HindⅢ;Bc，BclⅠ，E，EcoRⅠ;Bg，BglⅡ;EⅤ，EcoRⅤ;Bg/Bc，BglⅡ/BcⅡ連接;pEFlαA(嵌在方框內)，EFlαA的5′側(啟動子+5′引導序列);flori，噬菌體fl的復制起點;amp，氨芐青霉素抗性基因。 d)質粒沒有按照比例畫出?？s寫見c)。 圖8表示質粒pGb-SNENS的構建，示意地畫出質粒而不是按比例畫的。縮寫E，EcoRⅠ;H，HindⅢ;Sf，SfiⅠ;N，NotⅠ;flori，噬菌體fl的復制起點;amp，氨芐青霉素抗性基因。箭頭表示5′→3′方向。寡聚3和4表示人工合成的寡聚脫氧核苷酸的堿基序列。 圖9表示質粒pGb-RBZ的構建，質粒只是示意地畫出而沒有按照比例。縮寫E，EcoRⅠ，Bg，BglⅡ;H，HindⅢ，Hc，HincⅡ，B，BamHI;Sm，SmaⅠ;P，PstⅠ;flori，噬菌體fl復制起始點;amp，氨芐青霉素抗性基因。箭頭表示5′→3′方向，寡聚5和6表示人工合成的寡聚脫氧核苷酸的堿基序列。劃線的是所有解讀框內的TAA轉譯終止密碼。 圖10表示質粒pGbRBN3的構建。箭頭表示轉錄方向。質粒被示意地畫出而沒有按照比例?？s寫Sf，SfiⅠ;Sm，SmaⅠ;H，HindⅢ;flori，噬菌體fl復制起點;amp，氨芐青霉素抗性基因;G418，對G418有對照抗性的Tn5基因(由ADHI啟動子控制);EⅤ，EcoRⅤ;Hc，HincⅡ。 圖11表示質粒pGb-RBRR01的構建，質粒pGb-iRR01全部在圖7中描述和含受EFlαA啟動子(pEFlαA)控制的麥芽糖酶基因及受醇脫氫酶Ⅰ啟動子(pADHI)控制的麥芽糖滲透酶基因(兩個啟動子均標在方框內)。pGb-RBZ在圖9中描述。在pGb-RBRR01中SIT4分為兩個部分(“SIT4側”)。質粒只是示意地畫出而不是按比例的?？s寫參見圖10的說明。箭頭表示轉錄方向。 圖12描述一步基因破裂，步驟1用SfiⅠ消化pGb-RBN3，釋放出兩側均與SIT4基因區(qū)域同源的DNA片段，它直接整合到SIT4基因中(參見R.J.Rothstein(1983)inMethodsinEnzymology，101，202)，SIT4基因區(qū)域用條紋盒表示。示意地畫出兩個染色體等位基因。步驟2，用pUT332(沒有消化)和SfiⅠ消化后的pGb-RBRR01轉化得到的菌株ApGb-RNB3。共同轉化原理已有報導(參見A.H.Brand，I.Breeden，J.Abraham，R.SteiglanzandK.Kasmyth(1985)Cell41，41-48andP.Siliciano and K.Tatchell(1984)Cell 37，969-978)。第一次選擇我們利用腐草霉素抗性(質體pUT332)，但是，當然也可使用對其它抗生素如潮濕霉素B有抗性的2μ衍生游離質粒。pUT332和腐草霉素可以從Cayla，Avenue Larrien，Centre Commercial de Gros，31094Toulouse Cedex，F(xiàn)rance買到。在pUT332上，腐草霉素抗性基因從轉位子Tn5中得到和在一個酵母啟動子調節(jié)下定位。步驟3，從生長在非選擇培養(yǎng)基中的轉化體中去除游離質粒pUT332(愈合)。縮寫G418r，G418抗性基因(受ADHI啟動子控制);Sf，由SfiⅠ消化產生的DNA片段的末端;MAL，改變的麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶基。質粒的詳細細節(jié)也可參見圖9和11;+pUT332，游離質粒pUT332。 圖13表示麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶專一活性的增加與葡萄糖從培養(yǎng)基中消失的關系，對商品面包酵母如菌株A來說，這些曲線圖是典型的。 圖14表示在提高面團的刺激在培養(yǎng)基A中，菌株A及其它的rDNA衍生菌株的麥芽糖滲透酶的特異活性。 圖15表示菌株A及其它的rDNA衍生菌株在提高面團刺激的含有以麥芽糖作為主要碳源和能源的培養(yǎng)基A中培養(yǎng)的麥芽糖酶的特異活性。 圖16表示在提高面團的刺激下，菌株A和它的rDNA衍生菌株在含有以麥芽糖作為主要碳源和能源的培養(yǎng)基A中培養(yǎng)的麥芽糖發(fā)酵。 圖17表示在提高面團的刺激下，菌株A和它的rDNA衍生菌株在含有以葡萄糖為主要碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的麥芽糖發(fā)酵。 下列實驗數(shù)據(jù)詳細說明本發(fā)明，我們知道，熟悉這些方法的本領域的普通技術人員可能利用其它酵母菌株和載體能達到本發(fā)明的相同目的。這些改變也屬于本發(fā)明范圍。 克隆技術普通克隆技術的參考文獻已由Maniatisetal.編成手冊(T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook(1982)MolecularCloning，ALaboratoryManual)。利用制造商推薦的限制性酶，這些酶可以從NewEnglandBiolabs(Biolabs)，BethesdaResearchLaboratories(BRL)或從BoehringerMannheim(Boehringer)獲得，通常裂解1μg的DNA需要1至5個酶單位。 采用Cacl2技術可完成大腸桿菌的轉化(T.Maniatis et al.，Supra)。 重組質粒的構建1)pGb-eMAL6g該質粒在酵母中能自我復制，含有編碼麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶的基因，構建概況見圖1。 peG418從pEMBLYe23獲得(BaldariandG.Cesarini(1985)，Gene35.27)和在SaⅡ和HindⅢ位點之間含有Tn5基因片段(Ressetal.EMBOJ.(1984)3，3317)，Tn5基因對G418對照抗性，受來自酵母的醇脫氫酶Ⅰ(ADHI)啟動子調控，與Bennetzen和Hall描述的相似(J.C.BennetzenandB.D.Hall(1982)J.Biol.Chem.257，3018)。用HindⅢ裂解peG418，用CIP脫磷酸和與pY6×HindⅢ×PvuⅠ的消化產物連接。pY6已有描述(R.B.NeedlemanandC.Michels(1983)Mol.Cell.Biol.3，796;R.B.Needleman，D.B.Kaback，R.A.Dubin，S.L.Perkins(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，2811)和含有包含MAL6g位點的7.0KbHindⅢ片段。 2.pGb-eMAL61這個2μ衍生游離質粒含有編碼麥芽糖酶的基因，它們組建概況參見圖2。 pGb-eMAL6g含有2個BglⅡ位點，均位于麥芽糖酶基因內。用BglⅡ消化pGb-eMAL6g使1.4KbBglⅡ缺失，然后減緩重組合作用促進分子內連接。這種缺失損壞了麥芽糖酶功能(J.D.Cohen，M.J.Goldenthal，T.Chow，B.BuchfererandJ.Marmur(1985)Mol.Gen.Genet.20，1)。 3.pGb-eMAL63該2μ衍生游離質粒的DNA包括了MALp功能(調節(jié)蛋白基因或MAL調節(jié)子)。它的構建參見圖3。 從p21-40(R.B Needleman and C.Michels(1983)，Supra)分離KpnⅠ-SaⅡ片段，其中含有調節(jié)蛋白基因。用T4DNA聚合酶和Klenow-DNA聚合酶獲得鈍性末端的片段，然后再克隆到peG418的HindⅢ位點中去。 4.pGb-M6g(△-9)該質粒為啟動子缺失突變，基因間區(qū)域中將麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶表達基因分開(見圖4)，這個區(qū)域含有兩個基因的啟動子(S.H.Hong和J.Marmur(1986)Gene41，75)。得到這個缺失突變?yōu)榱巳〈紗幼?，這個構建包括下列步驟a)將含麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶的約7.5KbHindⅢ片段(見圖1)克隆到pTZ19R的HindⅢ位點中。這個質粒能夠買到(Pharmacia)，得到pGb-M6g。 b)用StnⅠ將pGb-M6g變成線形，在基因間區(qū)域切割。StuⅠ產生的末端作為內切酶Bal31的起點，這樣逐點去除含基因間區(qū)域啟動子(部分)。StuⅠ接近麥芽糖滲透酶基因(S.H.Hong和J.Marmur(1986)，Supra)。根據(jù)Maniatisetal(T.Maniatis，E.F.FritschandJ.Sambrook(1982)，Supra)描述的方法已經(jīng)培養(yǎng)出Bal31。在合適時間，從反應中取出樣品和KlenowDNA多聚酶一起保溫，得到鈍性末端。然后將合成的銜接物連接到有幾個限制性位點的末端上。 下列為所有的互補寡聚脫氧核苷酸1.5′GATATCCTCGAGAGGCCTA3′2.3′CTATAGGAGCTCTCCGGATGCGC5′產生EcoRⅤ(GATATC)、XhoⅠ(CTCGAG)，StuⅠ(AGGCCT)的雙鍵形式的限制性位點，在鈍性末端連接產生一個MluⅠ位點(ACGCGT)。根據(jù)(T.Maniatisetal.，(1982)Supra)描述的條件下，激酶作用后，將銜接物連接到Bal31處理過的DNA上。然后反應混合物用MluⅠ保溫，通過5mlSepharoseCl-2B柱層析，分離從DNA片斷中沒有連接的寡聚脫氧核苷酸。匯集含有該線性DNA的殘片，連接到質粒DNA中，再導入細菌。 c)將得到的缺失突變體進行序列分析，至此，利用輔助噬菌體對雙鍵質粒進行重復感染，使之變?yōu)閱捂淒NA(按照提供噬菌體推薦的方案)。用普通的M13程序純化單鏈模板用于二次脫氧序列分析(F.Sanger，S.Nicklen和A.R.Coulson(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463)。用人工合成寡聚脫氧核苷酸(5′-GAATTCGGTAGCGTTCACGC-3′)作為引物，與麥芽糖滲透酶基因ATG啟始密碼附近的伸張DNA互補。它的序列閱讀方向朝向啟動子(參見圖4)。 選擇大多數(shù)麥芽糖滲透酶啟動子被去除的缺失突變體進行進一步的實驗。麥芽糖啟動子(部分)仍存在(注位于基因間區(qū)域的作為內切酶處理起始點的StuⅠ位點是對稱的)。圖5列出了突變體pGb-M6g(△-9)缺失點序列。它是與最近測定的整個區(qū)域序列比較的(S.H.HongandJ.Marmur(1986)Supra)，與野生型序列比較，與發(fā)表序列有一個不同-878(根據(jù)S.H.HongandJ.Marmur(1986)Supra數(shù)據(jù))的C在我們的序列中是沒有的，因此，在這個位置不能用HpuⅠ或HincⅡ消化DNA。 質粒pGb-M6g(△-9)是融合其它啟動子與麥芽糖滲透酶基因和麥芽糖酶基因的起始質粒。 5.pGb-rA32/G418該質粒為一個整合酵母質粒，包括麥芽糖滲透酶基因，帶有醇脫氫酶Ⅰ啟動子和部分5′引導序列。它們構建如下(圖6)。 a)質粒pTZ19R/ADHⅠ含有一個1.4KbBamHⅠ片段和ADHⅠ啟動子，起始為-15位相關的AuG密碼(T.L.BennetzenandB.D.Hall(1982)J.Biol.Chem.257，3018)。從該質粒分離700bpEcoRⅤ-HincⅡ片段，與用EcoRⅤ消化pGb-M6g(△-9)的消化物連接。得到的質粒用限制性酶消化分析，對單鏈膜板進行二次脫氧序列分析確定合適的方向(見圖6)。利用4C描述的相同的寡聚引物。 ADHⅠ啟動子片斷克隆后，pTZ19R(BamHⅠ-HincⅡ)的部分聚銜接物位于麥芽糖滲透酶基因和ADHⅠ啟動子之間。pGb-A32的結構和序列見圖6a。 b)由主要的選擇標記G418res提供質粒pGb-A32。A1.9Kb EcoRⅤ/HincⅡ片段含G418對照抗性的由醇脫氫酶Ⅰ啟動子操縱的Tn5基因。通過質粒153-215AK的EcoRV/HincⅡ雙重消化分離該片段。將EcoRV/HincⅡ片斷克隆到pGb-A32的SmaⅠ位點中。產生pGb-iA32/G418。 6.pGb-iRRol該質粒是一個整合質粒，它含有由醇脫氫的Ⅰ啟動子操縱的麥芽糖滲透酶基因和由翻譯延長因子EFlαA的啟動子操縱的麥芽糖酶基因。克隆過程由圖7表示。方法如下麥芽糖酶基因含有約位于第五個氨基酸密碼附近的BcⅡ位點。所以，EFlαA編碼區(qū)域的誘變發(fā)生在起先五個氨基酸上，使之與麥芽糖酶蛋白的基因序列一致。BglⅡ位點在BcⅡ位點處共同導入，BclⅠ位點轉化為BglⅡ位點是第四個密碼的靜止突變。通過BglⅡ/BclⅠ的連接作用，EFlαA啟動子和引導序列可以融合到麥芽糖酶基因的其它位點。該方法包括如下步驟a)起始質粒為pYEF46(S.Nagata，K.Nagashima，Y.Tsunetsugu-Yokota，K.Fuyimura，M.Miyaraki and Y.Kaziro(1984)EMBO J.3，1825)，它含有編碼EFlαA的全套基因。分離復蓋該基因的2.5Kb BglⅡ片段，克隆到pTZ19R的BamHⅠ位點中。選出克隆pT4(見圖7a)用寡聚脫氧核苷酸直接誘變。 b)用輔助噬菌體重復感染后，分離單鏈(SS)DNA的pT4。400ng SS DNA、40ng熱變性pTZ19RX-BamHⅠ和100ng誘變寡聚脫氧核苷酸(見圖7b)于10μl體積的7mM Tris Hcl pH7.5;50mM Nacl和7mM Mgcl2的溶液中于50℃保溫10分鐘。室溫保持10分鐘后，加入1μl Klenow DNA聚合酶(2U)，1μl T4 DNA連接酶(4U)，1μl TMD(200mM Tris Hcl pH7.5，100mM Mgcl2，100mM DTT)，4μl 2.5mM dNTP-mix，1μl 10mM ATP和2μl H2O，開始第2鏈合成和連接。最終體積是20μl，在17℃保溫16小時，然后再將混合物轉化到大腸桿菌JM101中。利用激酶處理后的寡聚脫氧核苷酸尤其適于突變體(見圖7b)，通過克隆雜交篩選突變體。篩選寡聚物5′-GACTATTTCAGATCTTC-3′與導入的麥芽糖酶密碼和側面相接的核苷酸互補。雜交作用于25℃在6×NET(1×NET＝0.15M Nacl，0.015M Tris Hcl pH7.5，0.001MEDTA)中16小時完成。用相同混合物于相同溫度沖洗經(jīng)過雜交的物質(3次10分鐘)，然后于25℃在3×NET中沖洗。進一步分析幾個正集群，BglⅡ消化確定BglⅡ位點的存在。另外，從含有突變(pT4-M)的BglⅡ位點分離單鏈DNA，利用合成的17個核苷酸的引子與EFlαA基因87-103的核苷酸互補(S.Nagata，K.Nagashima，Y.Tsunetsugu-Yokota，K.Fuyimure，M.MiyarakiandY.Kaziro(1984)EMBOJ.3，1825)(5′-CAATACCACCACACTTG-3′)，進行二脫氧序列分析。獲得該序列確認已成功地獲得所期望的突變。 c)下一步是從pT4-M分離EFlαA啟動子麥芽糖酶/NH2-末端基因片斷，通過BglⅡ/BclⅠ粘性末端連接作用將其與麥芽糖酶基因的其它部分融合。這一步修復了EFlαA啟動子的麥芽糖酶編碼區(qū)域的下游部分和引導序列(見圖7c)。為了利用BclⅠ位點(對甲基化作用敏感)，用質粒pGb-Mbg(△-9)轉化一種大腸桿菌誘變菌株GM113(GM113thr，LeuB6，nroA2，tris-4，metB1，lacY1，galK2，ara-14，tsx33，thi-1，thyA12，deoB16，supE44，rpsL260，dam-3)。分離含有反除NH2末端的麥芽糖基因的3.8Kb BclⅠ/HindⅢ片斷。用BglⅡ/HindⅢ消化pT4-M，分離大的4.1Kb片斷(EFlαA啟動子/NH2末端和麥芽糖酶基因)。兩片斷相互連接，得到pGb-EFMT-3。序列分析確證所有導入的突變的正確性。 d)最后，用EcoRⅤ和HindⅢ(部分的)消化pGb-EFMT-3，純化4.8Kbp.EFlαA/麥芽糖酶啟動子/基因片斷。從pGb-iA32/G418(見圖6)分離大約8.3Kb的HindⅢ(部分的)/EcoRⅤ片斷，它包含pTZ19R的主鏈，ADHⅠ/麥芽糖滲透酶啟動子/基因片斷和ADHⅠ/G418res片斷，兩者連接產生pGb-iRRol(見圖7d)。 7.pGb-RB2該質粒作為將DNA碎片整合到酒酵母的SIT4基因中的克隆載體。它的構建步驟如下(見圖8和9)。 a.用EcoRⅠ和HindⅢ消化pTZ19R，代替人工合成的銜接物的40個核苷酸的DNA片斷。該片斷通過合成的寡聚脫氧核苷酸3和4(見圖8)的退火完成的。該短片斷具有EcoRⅠ和HindⅢ的粘性末端。這個DNA片斷向pTZ19R載體中的克隆沒有修復EcoRⅠ和HindⅢ位點。該合成的DNA片斷具有NotⅠ和SfiⅠ的近似限止位點和在中間有一個EcoRⅠ位點，得到的質粒稱作pGb-SNENS。 b.從pLF24(已知的也有編碼pLN420)中分離含SIT4基因(Gottlin-NingaandKaback，VideSupra)的EcoRⅠ片斷，再克隆到pGb-SNENS的EcoRⅠ的位點上。產生pGb-Spons31。由于缺乏有用的參考限制性位點，它的方向是末知的。 c.質粒pGb-Spons31在SIT4基因中間含有唯一的BglⅡ位點。它可作為任何通過基因置換轉化SIT4基因的DNA片斷克隆位點。為了促進克隆操作，給SIT4基因提供一個人工合成的、含有幾個唯一的限制性位點的DNA片斷。pGb-RB2的構建如圖9所示。 合成的DNA片段有兩個粘性的BglⅡ末端，在pGb-RB2中的方向如圖9所示，它的根據(jù)為pGb-RBN3的限制性酶分析(見下)。 8.pGb-RBN3將含由ADHⅠ啟動子操作的G418res基因的1.9Kb EcoRN/HincⅡ片段(也可參見pGb-iA32/G418的構建)克隆到pGb-RB2的SmaⅠ位點中。產生pGb-RBN3(圖10)。 9.pGb-RBRR01該質粒具有醇脫氫酶Ⅰ啟動子操縱的麥芽糖滲透酶基因和受EFlαA啟動子操縱的麥芽糖酶基因。兩者均位于8.3Kb HindⅢ片斷上，而后者已被克隆到SIT4基因中。它的構建參見圖11。至此，用HindⅢ消化pGb-iRR01，再與pGb-RB2xHindⅢ(用小牛腸道磷酸酶處理)連接，得到pGb-RBRR01。 10.pGb-RBREG01該質粒具有受醇脫氫酶啟動子控制的MAL調節(jié)子基因。 Ⅰ.pGb-RBREG01可由下列步驟構建。從p21-40(R.B.Needlaman and C.Michels(1983)，Supra)分離具有調節(jié)蛋白基因的SalⅠ片段。將該片段克隆到pTZ18R的SalⅠ位點。該質粒能夠買到(Pharmacia)，它的方向是MAL調節(jié)子基因的啟動子區(qū)域靠近pTZ18R的T7啟動子序列的方向。采用pTZ18R的序列引子和其它根據(jù)已獲DNA序列新合成的寡聚核苷酶引子，可以對MAL調節(jié)子基因的啟動子區(qū)域和NH2末端部分編碼基因進行序列測定，確定AUG起始密碼的位置。當在啟動子區(qū)域缺少有用的限制性位點時，按照普遍方法，通過用寡聚核苷酸定點誘變，將這樣一種位點(如BglⅡ)在靠近AUG終止密碼處導入也可參見節(jié)5b的重組質粒的構建。 在這種誘變后，將BglⅡ-SalⅠ片段(含有MAL調節(jié)子基因而無啟動子區(qū)域)和EcoⅤ-BanHⅠ片段(含ADHⅠ啟動子、可參見圖7d，pGb-iRR01連接可得到pGb-RB2(見圖9)，該MAL調節(jié)子基因則受ADHⅠ啟動子的控制。這樣將產生質粒pGb-iRBREG01。用二脫氧鏈方法和以寡聚核苷酸單鏈DNA作為模板進行序列分析，很容易確認克隆步驟和啟動子方向的準確性。 上面提到的質粒體構建僅僅作為實例說明本發(fā)明，其它啟動子(優(yōu)選地采用酵母菌屬)也能使用(或同一啟動子的其它部分)，也可選擇其它整合位點，使用酵母基因組中的一個或多子整合位點，可得到麥芽糖酶、麥芽糖滲透酶和MAL-調節(jié)子基因的組合(無論是由它們自己的啟動子還是由另外一個優(yōu)選于酵母菌屬的啟動子操縱)。最終，在整個厭氧發(fā)酵過程中，可得到麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶活性的滿意速率。 酵母菌轉化按照Ito等人的方法(H.Lto，Y.Fukuda，K.Murata，A.Kimura(1983)，J.Bacteriology153，163-168)，進行酵母菌株轉化。這里將酵母菌屬菌株在普通酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至密度為1至25，希望為4至10OD610nm。然后收獲酵母細胞，用離液序列高的離子尤其是堿金屬離子、鋰、銫或釹，具體些是它們的氯化物或硫酸鹽，更具體一些為鋰鹽、濃度為2mM至1.0M，優(yōu)選0.1M左右來沖洗和預處理。用離液序列高的離子將細胞培養(yǎng)約5至120分鐘，優(yōu)選60分鐘，在此之后再將細胞與DNA一起在平和的溫度下培養(yǎng)較短時間，通常約20-35℃，培養(yǎng)約5-60分鐘。加入25-50%的聚乙二醇，用等體積聚乙二醇稀釋整個培養(yǎng)基，濃縮到最終所期望的濃度。聚乙二醇將從約2，000至8，000道爾頓，優(yōu)選范圍約為4，000至7，000道爾頓。培養(yǎng)時間通常較短，約5至60分鐘，將培養(yǎng)的培養(yǎng)基于約35°-45℃(最好約42℃)熱處理約1至10分鐘，可以使用轉化體選擇的有用標記，如腐草霉素(D.Genilloud，M.C.Garrido，F(xiàn).Moreno(1984)Gene32，225)，潮霉素B(Gritzetal.(1983)Gene25，178)以及氨基糖苷G418(Jiminezeta.(1980)，Nature，287，869)。 當酵母細胞已用整合的質粒轉化時，采用BglⅡ消化DNA，整合作用直接于MAL位點進行。采用的整合質粒有兩個BglⅡ位點，兩者均在麥芽糖酶基因內，兩者相距1.4Kb。這樣發(fā)生雙鏈斷裂，引起基因內重組和刺激同源染色體DNA之間的反應。在整合時，通過染色體信息可修復缺口(T.L.Orr-Weaver，J.W.Szostak，R.Rothstein(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6354)。整合過程產生一個或幾個拷貝的質粒載體(J.W.Szostak，R.Cou(1979)Plasmid 2，536)。用于生產CO2實驗的，這些轉化體中的確切拷貝數(shù)沒有測定。 為了得到不含異源DNA的穩(wěn)定的酵母轉化菌株，制訂了一個方案。異源DNA有pTZ19R載體DNA和選有對抗生素G418、腐草霉素或潮霉素B參照抗性的基因。實驗解決方案簡述如下(圖12)1)通過用SfiⅠ消化pGb-RBN3后轉化酵母使得SIT4基因一步裂解。選擇抗G418的轉化體。結果是菌株ApGb-RBN3，其中SIT4基因已由有G418r基因打斷受ADHⅠ啟動子操縱的SIT4基因所代替。 2)在用pUT332和SfiⅠ消化過的pGb-RBRR01共同轉化方案中，采用菌株ApGb-RBN3作為受體菌株。pUT332為一個2μ衍生游離質粒，具有對腐草霉素有參照抗性的基因。共同轉化步驟的第一次選擇是在含有腐草霉素(30μg/ml)的平板上進行的。在這些腐草霉素抗性酵母細胞中有一定百分比(約為0.1至1%)細胞，其中打斷的SIT4基因(和pADHl/G418r)已被具有改變麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶基因的共同轉化SIT4片斷取代。這個第二次基因取代又產生了G418敏感酵母。為了選擇已發(fā)生第二次基因取代的酵母細胞，將腐草霉素抗性轉化體在含G418(300μg/ml)平板上復制平板。不生長的細胞中，包含在SIT4基因序列中的G418r基因已由改變的含于SIT4基因序列中的MAL基因取代。 3)將腐草霉素抗性G418sens轉化體在非選擇培養(yǎng)基中(例如無腐草霉素)培養(yǎng)，由游離質粒pUT332愈合，培養(yǎng)10-20代。得到的轉化菌株ApGb-pRBRR01對腐草霉素和G418均敏感且不含原核細胞序列。所有整合過程在DNA水平用Southern印跡實驗檢驗(沒有給出數(shù)據(jù))。 獲得的菌株可作為以后利用其它整合位點轉化時的和/或-當酵母菌株為二倍體或多倍體時-在其它SIT4基因的等位基因上轉化時的受體。菌株A是非整倍體的菌株，對于含SIT4基因的染色體是二倍體。菌株A的兩個SIT4基因均可作為基因取代的目標位點。最終產生轉化體ApGb-pZRBRR01＃1。利用兩個等位基因的整合最易提高轉化體的遺傳穩(wěn)定性，因為第二次整合消除了位點的多型性。這種多型性區(qū)域對基因轉變是敏感的，它使整合序列丟失。以這種方法得到的轉化體用Southern印跡技術分析，雜交類型表明如期望的那樣，在兩SIT4基因均有基因裂解。 作為pGb-RBN3和pGb-RBRR01的起始質粒的構建的載體pGb-RB2有幾個方面的有用的特征1.通常需要整合一個DNA片斷時，通過一個酵母啟動子與一個(酵母的)另外一個基因的編碼區(qū)域融合。假如轉化片斷具有與基因組內一個目標序列的兩則序列均同源，基因取代當然容易進行。所以，一個DNA片斷必須按在編碼區(qū)域的3′端(VideSupra)，該片斷則與啟動子選自同一基因。這種方法的缺點是需要許多次克隆操作，因為通常并不都是利用同一個啟動子。另外，通常選用強啟動子，它來自具有完成本發(fā)明任務的功能(營養(yǎng)期生長，厭氧發(fā)酵等)的基因。工程片斷的整合后，制造一個無功能的該基因的一個拷貝。 所以，我們希望直接在某一位點進行基因取代，它在營養(yǎng)生長期不表達。我們選取了SIT4基因(形成孢子誘導轉錄序列)，其表達已有Gottlin-Ninja和Kaback(Supra)進行了仔細研究，但是其它SIT基因或一般不編碼片斷當然也是合適的。當完成本發(fā)明目的的DNA構建物克隆到該SIT4基因中，得到的SIT4基因兩半作為重組的同源末端。 可以認為在營養(yǎng)生長期，基因所在的染色體區(qū)域轉錄不活躍，是一個靜止子的結果，與描述HMR-位點相似(A.H.Brandetal.(1985)Cecl41，41-48)。這個靜止子DNA也由啟動子操縱阻遏轉錄、與配對型的啟動子無關，在去除啟動子的2600bp后也能起作用。然而，Gotllin-Ninja和Kaback(Supra)已經(jīng)顯示了當HIS3基因整合到SIT4基因中，在營養(yǎng)生長期，它能發(fā)揮功能。 2.為了促進克隆操作，人工合成SIT4基因，其中含有幾個獨特的限制性位點(有克隆位點的多聚銜接物)。另外，在所有可能的解讀框內，多聚銜接物在兩側具有轉譯終止密碼(見圖a)。這是終止任何可能的雜種轉錄產物的轉譯，這雜種轉錄產物可能跨過連接處合成。否則的話這種雜種轉錄產物可編碼一種蛋白，它的作用是不知道的。 3.為了完成同源重組，整合在兩端具有NotⅠ和SfiⅠ(兩者識別8bp序列)的限制性位點的DNA片斷。這些限制性位點出現(xiàn)的頻率是相當?shù)偷模虼?，?DNA片斷克隆到含兩種識別位點的SIT4基因上的多聚銜接物上是非常困難的。于是，一旦將DNA片斷克隆到質粒pGb-RB2的SIT4基因上，即用NolⅠ或SfiⅠ限制性作用釋放出一個DNA片斷，它能通過同基因組內同源序列相互作用進行重組，例在SIT4位點。盡管這些末端是NotⅠ或SfiⅠ位點的部份，所以不同源，但是其它研究表明-在細胞內明顯地用限制性內切酶消化-這些序列被除去(例H.Rudolph，J.Koenig-RanseoandA.Hinnen(1985)Gene36，87-95)。 4.使用pUC19衍生物時，能買到的質粒pTZ19r作為起始質粒。該載體具有高拷貝數(shù)和擁有單鏈噬菌體fl的復制起始的優(yōu)越性。它非常容易分離-用輔助噬菌體感染后-單鏈DNA和借助引子證明DNA序列越過連接處。這就大大地促進了操作DNA的詳盡描述。 我們認為這些改進不僅可以應用于面包酵母，而且也可以用于其它酵母。 CO2產量測定a)在合成的面團培養(yǎng)基中(試驗A)在YEPMS培養(yǎng)基(1%酵母浸出液2%細菌蛋白胨;3.75%麥芽糖;1.28%蔗糖，添加200μg/ml G418)中培養(yǎng)酵母細胞，在30℃中生長直至對數(shù)生長后期。從6ml培養(yǎng)物中收集酵母細胞，再重新懸浮于8.8ml合成面團培養(yǎng)基中這個培養(yǎng)基的組成(每升)蔗糖4.6克;麥芽糖64.37克;KH2PO42.07克;MgSO4·7H2O2.76克;(NH4)2SO40.67克;酪蛋白水解物2.07克;檸檬酸4.02克;檸檬酸三鈉鹽44.25克;維生素B19.2毫克;維生素B69.2毫克;煙酸46毫克;D(+)泛酸鈣18.2毫克;生物素0.23微克。在28℃的水浴中，適度攪拌，使懸浮液在10分鐘內達到平衡，然后將裝有酵母懸浮液的燒瓶通過試管與“氣體滴定管”相連。該滴定管內裝滿液體，每升該液體有20ml指示劑溶液(1克甲基紅;0.5克美藍;溶于1升96%乙醇中)，40ml 1N H2SO4和痕量的CuSO4(溶于HNO3)。該溶液體積的置換來測定CO2產量，在165分鐘內測定。 在每次實驗中，得到的CO2產量值已通過分別將環(huán)境溫度和壓力換算為標準的28℃和760mmHg得以校正。另外，對酵母量進行校正。為了使每CO2測量的酵母量相平等，培養(yǎng)物在600nm處的比色閱讀用作校正因子。 b)在面團中(試驗B和B′)濃縮酵母生長在批量加入麥芽糖的面團中的CO2氣體釋放曲線已被測定，在面團中不加糖(精面團)(試驗B)或加30%糖(試驗B′)。精面團制備如下1g濃縮酵母(含28.5%的干物質)，34ml鹽溶液A(1.25g Nacl溶于34ml蒸餾水)和62.5g面粉在Hobart器中于速度1混合30秒，于速度2混合2分鐘，這樣得到處理較好的面團。 30%糖面團含有2.0g濃縮酵母(28.5%干物質)，34ml鹽溶液B(0.938gNacl溶于34ml蒸餾水)，62.5克面粉和18.75克蔗糖(即相對面粉為30%的糖)?；旌戏椒ㄅc用于精面團的方法相同。 然后將面團轉移到圓底燒瓶中。混合后7.5分鐘開始測定氣體產量，將裝有面團的燒瓶通過試管與氣體滴定管相連(見第a節(jié))，于28℃進165分鐘。在濃縮酵母的干物質含量不同于上面所指的值的情況下，這些酵母也被采用;然而，CO2氣體乘方的測定值再用CO2氣體乘方乘以所需干物質含量與實際測定值之比來校正。在每個實驗中，得到的CO2產量值用環(huán)境溫度和壓力分別為28℃和760mmHg來校正。在有些情況中還要進行其它計算，得到的氣體值用批量生產的酵母的N百分比來校正(%N表示蛋白含量)。改進的相似百分比不需要最后這步校正。 c)在面團中(試驗c和c′)干燥酵母(如按照US3843800和US4341871中描述的方法制備的速時干燥酵母)在不加糖(試驗c)或加30%糖(試驗c′)面團中的CO2產生曲線已經(jīng)測定。除了在試驗c和c′中分別使用300mg和600mg干燥酵母(含96%干物質)外，其它過程均與試驗B和B′相同。試驗前用面粉混合酵母，于28℃培養(yǎng)10分鐘。 酶的分析于30℃，用濃度15mM的〔U-14C〕-麥芽糖來測定酵母細胞的轉移麥芽糖能力。詳細過程已由R.Serrano(Supra)發(fā)表。在細胞自由浸出液中以p-硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷作為底物測定麥芽糖酶(E.C.3.2.1.20)。按照H.HalvorsonandE.L.Elias，Biochim.Biophys.Acta(1958)30，28的方法進行測定。 液體培養(yǎng)基中的底物消耗和產物形成用普通的HPLC技術來定量測定液體培養(yǎng)基中麥芽糖和葡萄糖的消耗。每升培養(yǎng)基含有100g麥芽糖，10g葡萄糖，3.0g(NH4)2SO4，4.0gMgSO4·7H2O，4gKH2PO4，4g酪蛋白水解物(Difco)，4g檸檬酸H2O，45g檸檬酸三鈉，H2O，10mg維生素B1，10mg維生素B6，40mg煙酸，20mg D(+)泛酸鈣和0.02mg生物素。將pH調至5.7。將2ml培養(yǎng)基加入酵母懸浮液(20mg干重/2.0ml蒸餾水)。該混合物稱作培養(yǎng)基A，于28℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基A相似但含有20倍的葡萄糖，實驗在厭氧條件下進行。 蛋白質測定細胞自由浸出物和整個細胞的蛋白用J.Goa，Scand.J.Chim.Lab.Invest.(1953)5，218的微量縮二脲方法測定，以卵清蛋白作為標準。 保持質量將濃縮酵母貯存在密閉塑料容器中于23℃放置4天。質量保持定義為這段時間后保持氣體產生能力的百分比。 濃縮酵母的制造將一酵母菌株于一系列發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在10升實驗室發(fā)酵罐中以6升凈體積培養(yǎng)細胞，通過自動控制，使發(fā)酵pH和溫度保持在期望的值。采用的發(fā)酵配方基于G.ButscheckandR.Kautzamann，DieHcfen，BandⅡTechnologiederHefenP.501-591(1962)，VerlagHansCarl，Nürnberg，F(xiàn)RG描述的方法，由G.Reed和H.J.Peppler在YeastTechnology，theAVIPublishingCompanyInc.，Westport，Connecticat，USA(1973)中發(fā)表。最終發(fā)酵的培養(yǎng)條件為-采用的糖蜜為80%的甜菜糖蜜和20%的甘蔗糖蛋，計算基于50%的糖。 -在接種前，如入的磷酸鹽是磷酸一銨。 -發(fā)酵期間的氮源是以表1中10%Mt3的水溶液形式提供的。 -在發(fā)酵的起先8小時中，pH保持5.0，然后根據(jù)表1在發(fā)酵結束時提高到6.2。 -每公斤糖蜜含有50%的水發(fā)酵糖，在接種前加入12mg維生素B1。 將發(fā)酵得到的酵母進行濃縮，在實驗室噴嘴離心機中用自來水沖洗。壓縮酵母膏狀物至干物質含量位于26%至32%之間。 獲得的蛋白質含量(%N×6.25)在干重的42-45%之間，在發(fā)酵期間提供不同含量的氨。 表1用于分批培養(yǎng)面酵母產品的發(fā)酵配方糖蜜量氨量接種后小時(加入總量的%)pHT(℃)(加入總量的%)＜07528.000-1-528.001-25528.002-36528.513-48528.574-58529.0115-68530.0116-710530.0127-810530.0158-9105.330.0179-10105.630.01710-11105.930.01011-1286.230.00例1用2μ衍生質粒轉化的、含有來自MAL6位點基因的酵母的CO2產量。 商業(yè)面包酵母菌株A和C已用pGb-eMAL6g(麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶，見圖1)，pGb-eMAL61(麥芽糖滲透酶、見圖2)和pGb-eMAL63(MAL-調節(jié)子，見圖3)轉化。MAL基因還包含它們的原始啟動子。轉化酵母菌株的命名如下ApeG418表示用peG418轉化的菌株A，其它轉化菌株已用相類似方法指出。在合成面團培養(yǎng)基中這些質粒對CO2產量量的效應總結于表2。用peG418(見圖1)轉化的受體菌株作為對照，因為我們發(fā)現(xiàn)僅僅有多拷貝的質粒對氣體產量也有負效應。 相對于對照，所有轉化體主要顯示CO2產量的改進。麥芽糖滲透酶和麥芽糖基因的額外拷貝的組合使得促進效應最高，在菌株A中約40%和在菌株C中約18%。 轉化菌株ApGb-eMAL6g和CpGb-eMAL6g也在不加糖的面團中試驗，這里在糖蜜中分批培養(yǎng)。 這樣又得到CO2產量的主要的改進(表3)。 表2與載體轉化菌株有關的、用2μ衍生MAL質粒轉化的菌株A和B氣體產量，CO2產量測定在合成面團培養(yǎng)基中進行(見實驗步驟)和校正至285mg干物質。數(shù)值是幾個實驗的平均值菌株100分鐘165分鐘ApeG418100100ApGb-eMAL6g157141ApGb-eMAL61144123ApGb-eMAL63119115 菌株100分鐘165分鐘CpeG418100100CpGb-eMAL6g121118CpGb-eMAL6l117114表3用2μ-衍生質粒peG418和pGb-eMAL6g轉化的菌株A和C在面團中的相對氣體產量，CO2產量校正至285mg干物質。 菌株60分鐘100分鐘120分鐘165分鐘ApeG418100100100100ApGb-eMAL6g125125125121CpeG418100100100100CpGb-eMAL6g151141138129例2用含重組麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因的整合質粒轉化的酵母菌株的CO2產量。 親代酵母菌株A已用pGb-iA32/G418(主要特性ADH1/麥芽糖滲透酶，見圖2)和pGb-iRROl(主要特性ADH1/麥芽糖滲透酶和EFlαA/麥芽糖酶;見圖7)轉化。 采用常用的有氧發(fā)酵方法，將親代菌株A和兩個轉化菌株在糖蜜中分批培養(yǎng)(見表1)，收獲細胞后用普通面包試驗(不加糖)測定CO2產量。本試驗中分析的氣體產量總結于表4。將pGb-iA32/G418整合到菌株A的染色體中后，大大改進了在面團中的氣體產量。相對改進結果根據(jù)測定時間有點變化。除改變的麥芽糖滲透酶基因之外，再采用pGb-iRRol將麥芽糖酶基因整合到商品菌株A的染色體中，氣體產生能力甚至進一步改進。在這典型實驗中相對于約410ml CO2/285mg酵母干重的水平，在精面團中165分鐘后多產生30%的CO2。 在30%糖面團中，轉化體與親代菌株的CO2產量沒有明顯的不同(約190ml CO2/285mg酵母干重)。 于23℃貯藏，獲得的發(fā)酵活性改進得以保持，貯藏期間發(fā)酵活性的丟失實際上對親代菌株A和新菌株來說是一致的(見表5)。 表4菌株A和它的具有改變麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因的rDNA衍生菌株的相對氣體產量。氣體值已校正至285mg干物質。面團中沒有加糖。 菌株60分鐘100分鐘120分鐘165分鐘A.100100100100ApGb-iA32/G418113115115111ApGb-iRRol131136138133表5菌株A及其它的具有改變麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶基因的rDNA衍生菌株的質量保持。濃縮酵母在23℃保持4天后，用表4的方法測定發(fā)酵活性。 菌株保持質量(原始發(fā)酵活性的%)A90ApGb-iA32/G41891ApGb-iRR0188例3具有麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶重組基因而不含異源DNA的酵母菌株的CO2產量。 已對親代菌株A進行了遺傳修飾，將pADHl麥芽糖滲透酶基因和pEFlαA/麥芽糖酶基因導入兩個同源染色體的SIT4基因中。該菌株其縮寫為ApGb-p2RBRR01＃1，它已用前面描述的方法及質粒(見質粒pGb-RBN3(圖10)和pGb-RBRR01(圖11)的轉化和構建部分)和普通的通過基因取代的轉化方案來構建。與常用的有氧發(fā)酵(見表1)相似，將親代菌株A和同源轉化體ApGb-p2RBRR01＃1在糖蜜中分批培養(yǎng)。收獲細胞后，用不加糖普通面團試驗測定CO2產量。 表6總結了結果。相對于約367ml CO2/285mg酵母干重的水平，在“精”面團中，165分鐘后，改進約為18%。該菌株具有由ADHI啟動子操縱的的麥芽糖滲透酶基因和受EFlαA操縱的麥芽糖酶基因的兩個拷貝。表4表明菌株ApGb-iRR01約有30%的改進。對整合到菌株A的MAL位點的pGb-iRR01分子數(shù)的初步估計，表明被整合的質粒分子拷貝數(shù)至少為3。通過大大增加菌株ApGb-p2RBRR01＃1中的改變麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶基因的拷貝數(shù)(如通過在其它形成孢子特異基因中整合)，可以得到氣體產量水平至少與菌株ApGb-iRR01相似的一個同源轉化酵母菌株。 表6菌株A和它的具有改變麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶基因的同源rDNA衍生菌株的相對氣體產量。氣體值已校正到285mg干物質。在面團中不加糖。 菌株60分鐘100分鐘120分鐘165分鐘A100100100100ApGb-p2RBRR01＃1124128127118例4用具有麥芽糖酶和/或麥芽糖滲透酶重組基因的整合質粒來轉化的酵母菌株的酶活性和底物攝入速率。 如上所述，麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶的表達易受麥芽糖的誘導和葡萄糖的阻遏。對菌株A野生型細胞的這種現(xiàn)象如圖13。只有至大部分葡萄糖被利用，麥芽糖滲透酶和麥芽糖酶的特異活性才增加。 將改變麥芽糖滲透酶基因導入酵母基因組C菌株ApGb-iA32/G418，在提高面團的進攻時，麥芽糖滲透酶活性增加。 意想不到的是，在這個構建中麥芽糖酶的活性也升高(圖15)。在含有麥芽糖作為主要碳源和能源的培養(yǎng)基A中，新菌株ApGb-iA32/G418發(fā)酵麥芽糖要比親代菌株A快(圖16)。在以葡萄糖作為主要碳源和能源的培養(yǎng)基B中，這種效應是不明顯的(圖17)。 除改變麥芽糖滲透酶基因之外在染色體中還整合改變麥芽糖酶基因產生菌株ApGb-iRR01。該菌株在培養(yǎng)基A中發(fā)酵麥芽糖的速率更高(圖16)和在培養(yǎng)基B中也高(圖17)。盡管細胞外葡萄糖濃度較高，該新菌株還能代謝相當大量的麥芽糖。在面團升高期間，菌株ApGb-iRR01較親代菌株A和菌株ApGb-iA32/G418有更高的麥芽糖酶和麥芽糖滲透酶活性(圖14和15)。 權利要求 1.一種與沒轉化親代酵母相比能提高糖發(fā)酵速度的轉化酵母，所說酵母包含至少有一個(最好同源的)DNA構建物存在于轉化后的所指酵母中，該DNA構建物至少含有一個在所述酵母中編碼促進一種轉運糖底物攝入和/或起始代謝轉化作用的蛋白質的基因，該基因能在所述酵母中表達。 2.根據(jù)權利要求1的酵母，其特征在于所述構建物至少含有一個編碼具有麥芽糖滲透酶麥芽糖酶或一個麥芽糖調節(jié)蛋白活性的酶的基因，或為它們的任意組合。 3.根據(jù)權利要求2的酵母，其特征在于所述基因或它們的組合受轉錄控制操縱，對葡萄糖阻遏不敏感和不需麥芽糖誘導。 4.根據(jù)權利要求2的酵母，其特征在于所述基因受醇脫氫酶I(ADHI)和/或轉譯延長因子(EFlαA)啟動子的轉錄調控。 5.根據(jù)權利要求4的酵母，其特征在于所述啟動子來自屬于酵母菌屬(Saccharomyces)的酵母，優(yōu)選的為酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)。 6.根據(jù)權利要求1-5的任一權利要求的酵母，其特征在于所述構建物為一游離成分的一部分。 7.根據(jù)上述任一權利要求的酵母，其特征在于所述構建物被整合到所述酵母的一個染色體中。 8.根據(jù)上述任一權利要求的酵母，其特征在于它至少含有兩個所述構建物。 9.根據(jù)上述任一權利要求的酵母，其特征在于所述酵母中不含異源DNA。 10.一種能提高將麥芽糖轉化為乙醇和二氧化碳的發(fā)酵速率的轉化酵母，其中含有一個幾乎不含原核DNA的DNA構建物，所述DNA構建物至少含有下列基因之一編碼具有麥芽糖酶、麥芽糖滲透酶或一個MAL調節(jié)蛋白活性的酶基因。 11.根據(jù)權利要求10中的酵母，其特征在于麥芽糖酶是受轉譯延長因子(EFlαA)啟動子的基因轉錄表達控制。 12.根據(jù)權利要求10或11中的酵母，其特征在于麥芽糖滲透酶受醇脫氫酶I(ADHI)啟動子的基因表達的轉錄控制。 13.根據(jù)權利要求10-12的任一權利要求中的酵母，其特征在于所述啟動子來自于屬于酵母菌屬(Saccharomyces)的酵母。 14.一種含有3%至8%水份的酵母，它通過干燥權利要求1-13的任一權利要求的酵母制得。 15.根據(jù)權利要求14的酵母，其特征在于所述酵母屬于酵母菌屬(Saccharmyces)，優(yōu)選的所述酵母為酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)。 16.一種通過沒有DNA參與轉化作用的菌株改進方法，利用權利要求1-15的任一權利要求的酵母可得到的酵母。 17.一種選自由下列菌株組成的組的酵母酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-iA32/G418，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-iRR01酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-eMAL6g，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-eMAL61，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-eMAL63，酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株CpGb-eMAL6g和酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-eMAL61酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株ApGb-p2RBRR01＃1 18.一種可從權利要求1-17中任一權利要求的酵母獲得的濃縮、速時干燥或活性干燥酵母。 19.一種可從權利要求1的轉化酵母獲得的濃縮酵母，它在試驗B中165分鐘內的氣體產量至少為340ml/285mg酵母干重和在試驗B′中165分鐘內的氣體產量至少為170ml/285mg酵母干重，較好的在試驗B中165分鐘內氣體產量為380-450ml/285mg酵母干重和在試驗B′中165分鐘內氣體產量為180-240ml/285mg酵母干重，最佳的是在試驗B中165分鐘內氣體產量至少為400ml/285mg酵母干重和在試驗B′中165分鐘內氣體產量至少為190ml/285mg酵母干重。 20.一種可從權利要求1中的轉化酵母獲得的濃縮酵母，其特征在于它在實驗B中165分鐘內氣體產量為400-500ml/285mg酵母干重，優(yōu)選的是在實驗B中165分鐘內氣體產量為440ml/285mg酵母干重。 21.一種可由干燥權利要求19或20的酵母獲得的速時干燥或活性干燥酵母。 22.一種可從權利要求1的轉化酵母獲得的干燥酵母，其特征在于它在試驗C中165分鐘內的氣體產量為310-360ml/285mg酵母干重和在試驗C′中165分鐘內的氣體產量為145-195ml/285mg酵母干重，優(yōu)選的是在試驗C中165分鐘內氣體產量至少為330ml/285mg酵母干重和在試驗C′中165分鐘內氣體產量至少為155ml/285mg酵母干重，或在試驗C中165分鐘內氣體產量為320-400ml/285mg酵母干重，優(yōu)選的在試驗C中165分鐘內氣體產量至少為350ml/285mg酵母干重。 23.一種選自下列組的載體pGb-eMAL6g，pGb-eMAL61，pGb-eMAL63，pGb-iA32/G418，pGb-iRR01和pGb-M6g(△-9)pGb-RBRR01pGb-RBN3pGb-RBREG01。 24.一種含有權利要求1-22的任一權利要求的酵母的面團或類似產物。 25.一種利用權利要求1-22的任一權利要求中的酵母生產發(fā)酵母粉產品、或酒精飲料和其它酒精產品的方法。 26.一種生產能提高糖發(fā)酵速率的轉化酵母的方法，其特征在于該方法包括至少一個同源DNA構建物導入酵母中，該DNA構建至少含有一個編碼促進轉運底物攝入和/或起始代謝轉變作用的蛋白的基因，所述導入作用包括有DNA介入的轉化作用或菌株改進的其它方法。 27.根據(jù)權利要求26的方法，其特征在于該構建物至少含有一個編碼具有麥芽糖酶、麥芽糖滲透酶或麥芽糖調節(jié)蛋白活性的酶的基因。 28.根據(jù)權利要求27的方法，其特征在于該構建物至少含有兩個所述基因。 29.根據(jù)權利要求27的方法，其特征在于所述基因分別受醇脫氫酶I(ADHI)和/或轉譯延長因子(EFlαA)啟動子的轉錄控制。 30.根據(jù)權利要求26-29的任一權利要求中的方法，其特征在于所述基因或它們的組合受轉錄控制調節(jié)而對葡萄糖阻遏作用不敏感和/或不需麥芽糖的誘導。 31.根據(jù)權利要求26-30的任一權利要求中的方法，其特征在于所述構建物是游離成分的一部分。 32.根據(jù)權利要求26-30的任一權利要求中的方法，其特征在于所述構建物被整合到所述酵母的染色體中。 33.根據(jù)權利要求26-32的任一權利要求中的方法，其特征在于它含有至少有兩個所述DNA構建物參與的導入作用。 34.根據(jù)權利要求26-30或32-33的任一權利要求的方法，其特征在于所述酵母不含異源DNA，采用基因置換技術進行基因向染色體中的整合作用。 35.根據(jù)權利要求34的方法，其特征在于一個染色體的形成孢子特異基因由具有已有權利要求26或32描述的基因插入的相同的形成孢子特異基因的DNA片斷取代。 36.根據(jù)權利要求29的方法，其特征在于所述啟動子來自屬于酵母菌屬的酵母。 37.根據(jù)權利要求26-36的任一權利要求的方法，其特征在于所述酵母屬于酵母菌屬，優(yōu)選的是酒酵母。 38.一種生產面團或類似產物的方法，其特征在于應用權利要求26-37的任一權利要求生產的酵母。 39.一種生產酒精飲料和其它酒精產品的方法，其特征在于使用權利要求26-37的任一權利要求生產的酵母。 40.一種生產面包或相關產品的方法，其特征在于使用了權利要求26-37任一權利要求生產的酵母。 41.一種生產具有麥芽糖酶或麥芽糖滲透酶活性的酶的方法，其特征在于使用了按照權利要求26-37的任一項權利要求的方法生產的酵母。 全文摘要 本發(fā)明涉及能改善糖發(fā)酵的酵母，得到這些酵母的方法和它們的使用方法。這些酵母顯示了較高的代謝速率，在含有糖如麥芽糖作為主要碳源和能源的培養(yǎng)基中可產生較高的二氧化碳和乙醇產量。在酵母中導入一個或多個至少含有一個編碼促進轉移底物攝入和/或起始代謝轉化的蛋白基因的DNA構建后，提高了糖發(fā)酵速率。 文檔編號C12N1/18GK1035678SQ8810706 公開日1989年9月20日 申請日期1988年8月25日 優(yōu)先權日1988年3月9日 發(fā)明者克拉斯·安妮, 奧斯英戈, 羅伯特·弗朗西卡斯·比尤德克爾, 約翰尼斯·伯特尤斯·范德普萊特, 約翰尼斯·亞伯拉罕·德霍爾安德 申請人:吉斯特-布羅卡迪斯公司 |
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