高效液相色譜常見8小問

Moia藏經(jīng)閣 2016-12-12

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1.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子
③可能柱超載，減少進樣量。

2.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么？

①樣品量不足，解決辦法為增加樣品量
②樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子
③樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器
④檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。
⑤檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)
⑥檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。
⑦檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。
⑧記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。
⑨流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。
⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

3.做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？

①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理；
②比例閥失效，更換比例閥即可；
③泵密封墊損壞，更換密封墊即可；
④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可；
⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

4.我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么？

柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因：
①拆去保護預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；
③將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過的柱子。
④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

5.色譜柱中的流動相會排干嗎？

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。
相比之下，另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如，經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。

6.為何出現(xiàn)峰展寬？

①樣品體積過大——用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
②在進樣閥中造成峰擴展——進樣前后排出氣泡以降低擴散
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢——設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點
④檢測器時間常數(shù)過大——設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%
⑤流動相粘度過高——增加柱溫,采用低粘度流動相
⑥檢測池體積過大——用小體積池,卸下熱交換器
⑦保留時間過長——等度洗脫時增加強溶劑含量,也可用梯度洗脫
⑧柱外體積過大——將連接管徑和連接管長度降至最小
⑨樣品過載——進小濃度小體積樣品