最近有朋友在公眾號后臺留言如何評估內(nèi)含子突變對基因的影響，今天又有一位朋友詢問剪切位點預(yù)測的軟件有哪些？雖然從表面上看這是兩個問題，但是在我看來內(nèi)含子突變對基因的影響主要體現(xiàn)在改變外顯子剪切上，所以可以看作一個問題：如何評估點突變對外顯子剪切的影響。

    從DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄出的最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中除去內(nèi)含子，并將外顯子連接起來形成一個連續(xù)的RNA分子的過程叫做RNA剪接。

ESE, exonic splicing enhancer; ESS, exonic splicing silencer; ISE, intronic splicing enhancer; ISS, intronic splicing silencer; ss, splice site

相關(guān)動畫如下：

    真核細(xì)胞pre-mRNA的剪接位點處存在一定的序列保守性，對于它所對應(yīng)的cDNA序列而言，內(nèi)含子5’端（供體位點）和3’端（受體位點）的堿基幾乎都是GT和AG，因此稱為GT-AG規(guī)則。如果在外顯子內(nèi)含子交界處發(fā)生突變（較多見）或內(nèi)含子內(nèi)部（少見）突變改變外顯子剪切方式或多出一段外顯子，將直接導(dǎo)致基因的功能改變，這樣的突變也稱為LOF突變（loss of function）。

游俠將以幾個知名的案例來講解幾個軟件的評估效果。

     中日友好醫(yī)院顧大夫新浪微博記載《基因檢測結(jié)果解讀——從一個家庭的困惑說起》，8歲男孩，1歲6個月步態(tài)不穩(wěn)，2歲后吐字不清， 7歲后行走能力下降，小腦萎縮。經(jīng)三家基因檢測公司最后確診為PLA2G6基因上的兩個突變引起，其中一個為剪切位點突變c.1077G＞A。（基因組位置chr22:38528838C>T，hg19）

    一對來自河北衡水農(nóng)村的貧困姐弟倆，先天失聰、失語，且存在嚴(yán)重視力障礙--視網(wǎng)膜色素變性。姐弟均雙耳全聾、視力進(jìn)行性減退、夜盲、紅綠色盲、視野縮小、雙眼眼球震顫，經(jīng)過藥明康德明碼生物基因檢測確診為MYO7A突變引起的Usher綜合征，其中一個突變位點為剪切位點c.849+2T>C（基因組位置chr11:76868440T>C，hg19 ）

    654β地中海貧血，, HBB基因第二內(nèi)含子654 突變是最常見的導(dǎo)致 β地中海貧血發(fā)生的突變類型之一 。該突變在 β 珠蛋白基因第二內(nèi)含子第 654 位發(fā)生 C >T突變（NM_000518.4:c.316-197C>T, rs34451549，基因組位置chr11: 5247153G>A），形成一個新的 5' 供體剪接位點, 同時又激活了IVS Ⅱ第 597 位一個潛在的 3' 受體剪接位點, 導(dǎo)致IVS Ⅱ中這兩個新的剪接位點之間一段長 73 bp 的序列被作為額外的外顯子插入到外顯子 2 和 3 之間，產(chǎn)生一種異常的 mRNA，從而引起β地貧表型。

     第一個評測軟件為scSNV，相關(guān)文獻(xiàn)如下（pmid：25416802），該軟件主要使用機器學(xué)習(xí)的方法對之前已報導(dǎo)的剪切位點突變進(jìn)行訓(xùn)練識別，從而可以對新的剪切位點進(jìn)行預(yù)測評估。

通過Annovar軟件結(jié)合scSNV數(shù)據(jù)庫對以上案例一與案例二兩個位點進(jìn)行評估，第三個案例距離剪切位點邊界太遠(yuǎn)，scSNV只評估：?3 to +8 at the 5`splice site 和?12 to +2 at the 3`splice site區(qū)域內(nèi)突變。

結(jié)果如下

數(shù)據(jù)庫運用兩種算法AdaBoost與random forests，任一種得分大于0.6即認(rèn)為改變剪切，數(shù)值越大越有可能改變剪切，從結(jié)果來看，svSNV預(yù)測的非常準(zhǔn)。

    第二個軟件為HSF 3.0，網(wǎng)址為http:///HSF3/，該算法主要是應(yīng)用各種剪切相關(guān)蛋白的識別的序列motif進(jìn)行識別，不但可以識別潛在的剪切位點還可以識別branch point突變。具體算法介紹參見pmid：19339519。

首先我們需要用UCSC view DNA工具提取三個位點附近各50bp序列。

PLA2G6 >hg19_dna range=chr22:38528788-38528888 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none

TGCATTCCCACCGGGGCCCCACAGGGCAGGACACGCGGTCCTGGGCTCAC

CGACATGGCCAGGTGCAGCGGGGTGTTGCCGTGCTCTCCGCGGGCATCCG

C

HSF預(yù)測結(jié)果如下：

MYO7A>hg19_dna range=chr11:76868390-76868490 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none
GAAGAAGCTGGGCTTGGGCCAGGCCTCTGACTACAACTACTTGGCCATGG
TGAGGCCCAGGTGGGCCCCTGGGTAGGGGGGCACCCACCCTAGGATTGTA
G

HSF預(yù)測結(jié)果如下：

HBB >hg19_dna range=chr11:5247103-5247203 5'pad=0 3'pad=0 strand=+ repeatMasking=none
TCAGTTACAATTTATATGCAGAAATATTTATATGCAGAGATATTGCTATT
GCCTTAACCCAGAAATTATCACTGTTATTCTTTAGAATGGTGCAAAGAGG
C
HSF預(yù)測結(jié)果如下：

從分析結(jié)果來看，HSF分析的準(zhǔn)確度并不高，三個位點只有一個位點預(yù)測準(zhǔn)確。

    第三個軟件為SPIDEX，由基因組學(xué)深度學(xué)習(xí)知名機構(gòu)Deep Genomics出品，該算法使用最新的深度學(xué)習(xí)的方法對已有的資料進(jìn)行訓(xùn)練，可以對剪切位點附近300bp以內(nèi)的位點進(jìn)行識別預(yù)測，相關(guān)文獻(xiàn)參見pmid：25525159。

該軟件為商業(yè)化軟件，企業(yè)需要付費購買，有一個免費的網(wǎng)頁可以查詢http://tools.genes./。

以上為初步的位點比對，SPIDEX不能識別HBB內(nèi)含子突變。對于其他兩個位點，預(yù)測結(jié)果如下

根據(jù)文獻(xiàn)建議當(dāng)dPSI_percentile小于3時可認(rèn)為引起可變剪切，從結(jié)果來看案例一預(yù)測數(shù)值為1.3預(yù)測準(zhǔn)確，案例二預(yù)測數(shù)值為0.07預(yù)測準(zhǔn)確。

       雖然只是測試了三例，評估不是非常客觀，但是管中窺豹，從以上的結(jié)果中我們可以看到對于剪切位點附近的突變，scSNV與SPIDEX預(yù)測最好，游俠還是推薦scSNV，因為scSNV已有免費全基因組范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)庫，結(jié)合annovar軟件非常方便，當(dāng)然為了確保結(jié)果最好還是用SPIDEX相互驗證一下為好。對于內(nèi)含子內(nèi)部的位點，目前軟件很難預(yù)測準(zhǔn)確，當(dāng)懷疑為內(nèi)含子突變引起的可變剪切時，也許做一個RNA逆轉(zhuǎn)錄是比較實際的方法。特別提示，在本測試案例一中，突變位點為同義突變，在臨床工作中很容易遺漏，為了避免這類情況，HGMD專業(yè)數(shù)據(jù)庫與可變剪切位點預(yù)測非常有必要。