作者：王穎超 等

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科

摘自《中國(guó)當(dāng)代兒科雜志》2017 年第 1 期

患兒，男，3 歲 9 個(gè)月，因發(fā)熱 20 d 入院。患兒入院前 20 d 受涼后出現(xiàn)不規(guī)則發(fā)熱，熱峰 39.5℃左右，伴陣發(fā)性腹痛（臍周為主），無咳嗽、咳痰、流涕，無寒顫、抽搐、驚厥，無皮疹、關(guān)節(jié)疼痛，無頭痛、惡心、嘔吐等，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予以抗感染（具體用藥不詳）治療，效果欠佳。起病以來，患兒神志清楚、熱退后精神、食欲可，大小便正常。

既往體健。出生史、喂養(yǎng)史、生長(zhǎng)發(fā)育史、家族史均無特殊。

體溫 39.0 ℃，脈搏 132 次/min， 呼吸 26 次/min，血壓 96/62 mm Hg，體重 15 kg。神志清楚，精神差，全身皮膚無蒼白、黃染、色素脫失斑及出血點(diǎn)，頸部及腹股溝可觸及數(shù)個(gè)腫大淋巴結(jié)，最大約 2 cm×1 cm，質(zhì)中，無壓痛， 活動(dòng)度可。球結(jié)膜無充血，眼球無震顫，瞳孔等大等圓、對(duì)光反射靈敏。口唇無發(fā)紺，口腔黏膜無破潰，無異常分泌物，咽充血，雙側(cè)扁桃體 Ⅱ°腫大。心肺無異常。腹平軟，肝臟肋緣下約 3 cm、劍突下約 4 cm，脾肋下約 3.5 cm，質(zhì)韌、界清、無壓痛，腸鳴音正常。脊柱四肢無畸形。肛門外生殖器無異常，神經(jīng)系統(tǒng)體查無異常。

血常規(guī)：
白細(xì)胞：2.6×10⁹/L
中性粒細(xì)胞：0.2×10⁹/L
血小板：93×10⁹/L
血紅蛋白：72.0 g/L

大小便常規(guī)、心肌酶、腎功能、免疫球蛋白、心電圖均未見明顯異常。

電解質(zhì)：
鈉：122 mmol/L（正常范圍：135~153 mmol/L），余正常；
C- 反應(yīng)蛋白：6.88 mg/L（正常范圍：0~5 mg/L）
降鈣素原：0.43 ng/mL（ 正常范圍：0~0.20 ng/L）

EB 病毒 IgM、IgG 均陽性
EB 病毒 DNA：6.59×103/mL（<>10²/mL）

肝功能：
谷丙轉(zhuǎn)氨酶：234 U/L（正常范圍：0~40 U/L）
谷草轉(zhuǎn)氨酶：195 U/L（正常范圍：0~40 U/L）
甘油三酯：2.30 mmol/L（正常范圍：<1.7>

血清鐵蛋白：1286.9 ng/mL（正常范圍：30~400 U/L）；

凝血功能：
FIB：1.1 g/L（正常范圍：2.0~4.0 g/L）
APTT：51 s（正常范圍：26~40 s）
TT：20 s（正常范圍：10~18 s）
D-Dimer：2.3 mg/L（正常范圍：0~0.3 mg/L），余正常；

NK 細(xì)胞百分比：2.0%（正常范圍：5.0%~27.0%），
NK 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)：280/μL（正常范圍：150~1100/μL）。

腹部彩超：肝大，脾大，腸系膜多發(fā)腫大淋巴結(jié)。

肺部 CT：雙肺炎癥。

骨髓細(xì)胞學(xué)（圖 1）：骨髓增生明顯活躍，粒紅比值正常，全片有核細(xì)胞未見包涵體， 可見吞噬細(xì)胞（吞噬粒細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和血小板）。

患兒父母 EB 病毒 IgM 均陰性、IgG 均陽性，EB 病毒 DNA 均 <>10²/mL。

經(jīng)家屬知情同意，將患兒及其父母血標(biāo)本送檢至康圣環(huán)球醫(yī)學(xué)特檢集團(tuán)，通過高通量測(cè)序（NGS）法，使用 Life Technologies 公司的 IonProton 測(cè)序儀檢測(cè)家族性噬血細(xì)胞綜合征（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis，F(xiàn)HL）10 個(gè)相關(guān)基因，PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、XIAP、SH2D1A、Rab27a、AP3B1、LYST、ITK，使用 DNAstar 軟件包中的 Seqman 進(jìn)行測(cè)序基因與正常 LYST 基因的比對(duì)分析。

患兒及其父親 LYST 基因有一處雜合突變：第 46 號(hào)外顯子 10526 位 G→A，導(dǎo)致編碼的 3509 位精氨酸被谷氨酰胺代替（Arg→Gln，Arg3509Gln），為錯(cuò)義突變，患兒母親第 46 號(hào)外顯子測(cè)序未發(fā)現(xiàn)此突變（圖 2）。經(jīng)檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和最新文獻(xiàn)，位于第 46 號(hào)外顯子的突變 c.10526G>A（p.Arg3509Gln） 為新突變，該突變?cè)谌巳褐邪l(fā)生率極低，排除其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）。

療第 20 周再次入院時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血 NK 細(xì)胞和 CTL 細(xì)胞在刺激前后的細(xì)胞膜 CD107a 分子表達(dá)。與刺激前相比，刺激后CD107a 分子在 NK 和 CTL 細(xì)胞膜上的表達(dá)增加，但增加幅度低于正常參考范圍，表明患兒 NK 和 CTL 細(xì)胞脫顆粒功能存在異常（見表 1）。

患兒發(fā)熱 20 d，伴有脾大、血細(xì)胞三系減少、FIB 明顯減少、TG 升高、血清鐵蛋白顯著增高，以及骨髓涂片發(fā)現(xiàn)噬血細(xì)胞，符合噬血細(xì)胞綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)，按 2004-HLH 方案（地塞米松、環(huán)孢霉素、依托泊苷）規(guī)律化療，輔以抗感染、粒細(xì)胞集落刺激因子、成分輸血等支持治療，治療第 2 周體溫、血常規(guī)基本正常， 肝功能、TG、FIB、鐵蛋白等提示已緩解；治療第 5 周，患兒再度出現(xiàn)持續(xù)高熱，復(fù)查血常規(guī)、肝功能、血脂、凝血功能等提示復(fù)發(fā)，家族性噬血細(xì)胞綜合征相關(guān)基因測(cè)序結(jié)果提示患兒及其父親的 LYST 基因存在雜合突變，診斷原發(fā)性噬血細(xì)胞綜合征，建議干細(xì)胞移植，家屬拒絕，繼續(xù)原方案化療，病情緩解，第 6 周出院，出院后予以維持治療，第 9 周復(fù)查 HLH 指標(biāo)穩(wěn)定；第 20 周患兒再次出現(xiàn)持續(xù)高熱，血常規(guī)、肝功能、血脂、凝血功能、鐵蛋白等提示 HLH 復(fù)發(fā)，行細(xì)胞毒脫顆粒檢測(cè)（CD107a 激發(fā)實(shí)驗(yàn)），顯示：ΔNK-CD107a 為 3.72%，CTL 細(xì)胞 ΔMFI 為 1.5，考慮原發(fā)性噬血細(xì)胞綜合征復(fù)發(fā)，再次建議行干細(xì)胞移植，目前等待移植中。

原發(fā)性噬血細(xì)胞綜合征（primary hemophago-cytic syndrome，pHPS），又稱原發(fā)性噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥（primary hemophagocytic lymphohistiocytosis，pHLH），是由多種因素導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，引起單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)反應(yīng)性增生、大量細(xì)胞因子釋放、導(dǎo)致多臟器浸潤(rùn)及全血細(xì)胞減少為特征的疾病。它是一種常染色體或 X 連鎖隱性遺傳病，包括 FHL 和原發(fā)性免疫缺陷病相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征（immunodeficiency related hemophagocytic lympho-histiocytosis，iHLH）。FHL 有 5 個(gè)亞型，F(xiàn)HL1~FHL5。iHLH 包括 Chediak-Higashi 綜合征 1 型、Griscelli 綜合征 2 型、Hermansky-Pudlak 綜合征Ⅱ型和 X-連鎖淋巴增殖綜合征（XLP，包括 XLP-1 和 XLP-2）等。pHLH 相關(guān)的基因缺陷包括 PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、XIAP、SH2D1A、Rab27a、AP3B1 和 LYST。越來越多研究提示，即使基因檢測(cè)為雜合突變，在一定條件下仍可診斷 pHLH。

pHLH 在亞洲地區(qū)發(fā)病率較高，可達(dá) 3.42/100 萬，男性：女性為 1 : 1。90％的患兒發(fā)病年齡小于 2 歲，少數(shù)可延遲至青春期甚至成年后發(fā)病；而遲發(fā)性 pHLH 特別是年長(zhǎng)兒和成人發(fā)病者逐漸增多，目前報(bào)道的 pHLH 最大發(fā)病年齡為 62 歲。

溶酶體運(yùn)輸調(diào)節(jié)因子基因（lysosomal trafficking regulator gene，LYST），定位于常染色 lq42.1-42.2，全長(zhǎng) 205 878 kb，含 52 個(gè)內(nèi)含子、53 個(gè)外顯子，編碼LYST。LYST 含 3 801 個(gè)氨基酸，參與溶酶體形成和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過程。LYST 基因突變位點(diǎn)散布于大的編碼區(qū)內(nèi)，突變點(diǎn)約 50 多個(gè)，多為無義突變、錯(cuò)義突變和框移突變，如 c.11362G>A（p.G3725R）、c.961 T>C（p.C258R）和c.925C>T（p.R309X）。LYST 基因突變位點(diǎn)也可位于內(nèi)含子，如 c.7060-1 G>A，NM_000081。LYST 基因突變導(dǎo)致細(xì)胞毒性顆粒不能正常釋放，積聚成大的顆粒，致使 CTL 和 NK 細(xì)胞不能有效清除被感染細(xì)胞；巨噬細(xì)胞被活化的 T 細(xì)胞刺激，分泌過量細(xì)胞因子，使 T 細(xì)胞及巨噬細(xì)胞處于失控的活化狀態(tài)，繼而表現(xiàn)出 HLH 的一系列癥狀。

本研究通過 NGS 發(fā)現(xiàn)患兒及其父親 LYST 基因有一處雜合突變，而且 CD107a 激發(fā)實(shí)驗(yàn)陽性，支持 pHLH 的診斷。溶酶體相關(guān)膜蛋白 -1（LAMP-1 或 CD107a）是一種高糖基化蛋白，約占溶酶體膜蛋白的 50%，當(dāng) NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞毒顆粒將到達(dá)漿膜面并與細(xì)胞膜融合，引起顆粒內(nèi)容物釋放，最終殺死靶細(xì)胞。隨著脫顆粒的發(fā)生，CD107a 分子被轉(zhuǎn)運(yùn)至膜表面，并且 CD107a 分子的表達(dá)上調(diào)與穿孔素的分泌一致，因此，CD107a 表達(dá)率可以反映 NK 細(xì)胞殺傷活性。有學(xué)者提出，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穿孔素或者 CD107a 激發(fā)試驗(yàn)對(duì)于靜息狀態(tài)下NK 細(xì)胞和/或 CTL 細(xì)胞功能的反映具有一致性。Bryceson 等對(duì)可疑 HLH 患者進(jìn)行 CD107a 激發(fā)實(shí)驗(yàn)前瞻性隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)靜息狀態(tài)下 NK 細(xì)胞 CD107a 低于 5% 對(duì)于 FHL 診斷的敏感性為 96%、特異性為 88%。近年來研究提示，即使基因檢測(cè)陰性或?yàn)殡s合突變，在一定條件下仍可診斷為 pHLH。Spessott 等曾報(bào)道存在 STXBP2 基因雜合突變的患兒，因其相關(guān)蛋白 munc18-2受影響而干擾溶酶體顆粒釋放，最終診斷為 FHL5；周曉?shī)芯恐杏?2 例患兒，1 例 PRF1 基因存在雜合錯(cuò)義突變 V50L，1 例PRF1 基因存在雜合錯(cuò)義突變 R489W，綜合穿孔素或顆粒酶 B 表達(dá)異常，明確診斷為 FHL2。

本研究患兒及其父親的 LYST 基因均出現(xiàn)同一雜合突變，但患兒發(fā)病、父親無癥狀，推測(cè)有以下原因：

（1）本研究患兒的 CD107a 明顯降低，但因條件所限未完善患兒父親的 CD107a 以及 LYST 蛋白檢測(cè)，患兒父親目前處于無病狀態(tài)，不排除其 CD107a 和 LYST 蛋白均正常的可能。
（2）pHLH 是常染色體或 X 連鎖隱性遺傳病，但單純的基因缺陷有時(shí)并不能夠?qū)е录膊〉陌l(fā)生，往往由繼發(fā)因素包括感染、免疫缺陷病、腫瘤及組織損傷等誘發(fā)，在兒童時(shí)期多為細(xì)菌或病毒感染誘發(fā)，而成人常為感染、惡性淋巴瘤及免疫性疾病等誘發(fā)。本研究患兒存在 EB 病毒感染，而患兒父親無誘發(fā)因素。
（3）目前發(fā)現(xiàn)的 pHLH 相關(guān)基因有 PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、XIAP、SH2D1A、Rab27a、AP3B1 和 LYST， 但辛辛那提兒童醫(yī)療中心診斷的 HLH 患兒有一半以上不能用這些基因缺陷解釋，提示將近一半的 pHLH 相關(guān)基因未被克隆出來，因此不能排除該患兒尚存在某些未被檢測(cè)到的致病基因。
（4）某些不典型突變所處區(qū)域編碼的分子功能并不很重要，一般處于沉默狀態(tài)，雖然可以導(dǎo)致 NK 細(xì)胞和 CTL 功能障礙，但無典型的 HLH 臨床表現(xiàn)，稱為溫和突變，這可能是部分 pHLH 發(fā)病延遲的原因?；純焊赣H長(zhǎng)期處于無病狀態(tài)，不排除該突變位點(diǎn)為溫和突變的可能性。pHLH 相關(guān)的基因突變及其對(duì)特定蛋白質(zhì)的作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上，pHLH 診斷困難，可通過基因檢測(cè)確診， 但基因檢測(cè)陰性或僅為雜合突變時(shí)，需要結(jié)合臨床特征、相關(guān)基因的蛋白表達(dá)以及 CD107a 激發(fā)實(shí)驗(yàn)。深入地研究 pHLH 相關(guān)基因突變及其與特定蛋白質(zhì)的相互作用，了解基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致 CTL 和 NK 細(xì)胞功能障礙、建立 pHLH 快速診斷方法是今后努力的方向。