關(guān)于日立生化分析儀，想必檢驗(yàn)科的各位老師都不陌生，自90年代初進(jìn)入中國(guó)以來(lái)，有許多大家熟悉的機(jī)型，例如單機(jī)最快的7180、模塊組合式的7600，還有7020、7170、7150、LST003、LST008以及最新的3100、LST008AS，今年還在日本最新上市了五合一型的3500多功能型自動(dòng)化設(shè)備。

日立公司一直以技術(shù)為主導(dǎo)，致力于提供更加準(zhǔn)確地?cái)?shù)據(jù)。我們采用世界獨(dú)一無(wú)二的凹面蝕刻光柵，保證分光的準(zhǔn)確；專(zhuān)利技術(shù)的高耐磨陶瓷材料制成的吸樣注射器，配合先進(jìn)的數(shù)字步進(jìn)馬達(dá)，保證加樣的準(zhǔn)確；循環(huán)恒溫水浴技術(shù)，保證反應(yīng)體系的恒定。

同時(shí)，為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠，軟件系統(tǒng)除使用方便之外，還兼顧著許多非常重要的功能，例如數(shù)據(jù)的報(bào)警，它可以進(jìn)一步幫助我們更好地判斷數(shù)據(jù)的可靠性。

本周為大家介紹關(guān)于酶類(lèi)項(xiàng)目底物耗盡限的內(nèi)容。

數(shù)天前，有用戶(hù)問(wèn)：一患者的ALT結(jié)果是-1u/L，但是既往結(jié)果（3天前）卻是1574u/L，臨床診斷是肝硬化。在了解情況后，得知結(jié)果重復(fù)性很好，有數(shù)據(jù)“I”的報(bào)警，反應(yīng)曲線與正常曲線差異很大，出現(xiàn)了底物耗盡。

反應(yīng)曲線分析：

ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶），設(shè)定的測(cè)光區(qū)域是22-28。如圖一所示的數(shù)據(jù)反應(yīng)曲線，濃度值是-1U/L，結(jié)果明顯異常，從圖可知在17-21點(diǎn)，也即延遲期內(nèi)，底物消耗過(guò)快，從起始吸光度約11000，在21點(diǎn)時(shí)，降到了200以?xún)?nèi)。但在正常的測(cè)光區(qū)域（22-28點(diǎn)）反而沒(méi)有吸光度的變化，導(dǎo)致結(jié)果計(jì)算錯(cuò)誤，不符合真實(shí)情況。應(yīng)適當(dāng)稀釋標(biāo)本重新進(jìn)行測(cè)定，觀察反應(yīng)曲線有無(wú)其他異常。

圖一 反應(yīng)曲線圖

在動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)的生化反應(yīng)中，由于標(biāo)本酶含量過(guò)高，導(dǎo)致反應(yīng)體系中酶的底物短時(shí)間內(nèi)消耗殆盡，使得之后的反應(yīng)吸光度變化近乎為零，反應(yīng)曲線成為一段較為平坦曲線，其斜率不符合實(shí)際情況，所得結(jié)果也不符合真實(shí)值，這種現(xiàn)象稱(chēng)為底物耗盡。

酶促反應(yīng)不同于一般催化反應(yīng)，反應(yīng)不是瞬時(shí)完成的，而是經(jīng)過(guò)一個(gè)進(jìn)程。酶分子要和底物分子結(jié)合，然后才能催化底物反應(yīng)。

反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，酶與底物分子結(jié)合很少，反應(yīng)速度很慢，底物或產(chǎn)物的變化量與時(shí)間不成正比，這一時(shí)期稱(chēng)為延遲期。延遲期的時(shí)間一般為數(shù)秒鐘到數(shù)分鐘，這也就是為什么所有廠家的酶類(lèi)項(xiàng)目，在參數(shù)設(shè)置時(shí)，測(cè)光點(diǎn)都會(huì)選擇在啟動(dòng)反應(yīng)試劑（雙試劑時(shí)，為試劑二）加入一段時(shí)間之后；隨著時(shí)間的推移，酶與底物分子結(jié)合增多，反應(yīng)速度加快，底物或產(chǎn)物的變化量與時(shí)間成正比，這一時(shí)期稱(chēng)為線性期（也稱(chēng)零級(jí)反應(yīng)期）。試劑廠家，按照其試劑的特性，確定線性期測(cè)光點(diǎn)，極為重要；隨著底物的減少和產(chǎn)物的增加，逆反應(yīng)增強(qiáng)，反應(yīng)速度減慢，偏離線性期。（圖二）

底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度有很大的影響，只有當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí)，酶促反應(yīng)速度才能保持恒定，此時(shí)的酶促反應(yīng)速度與酶活性才有線性關(guān)系，因此，只有在零級(jí)反應(yīng)期，單位時(shí)間內(nèi)吸光度（A）變化值才與酶活性成正比。（圖三）

酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線如下圖二、圖三所示：

速率法，連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物的濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)（圖四&圖五）,求出酶反應(yīng)初速度,間接計(jì)算酶活性濃度的方法。通常用于酶類(lèi)項(xiàng)目，例如：ALT、AST、LDH等。

酶類(lèi)項(xiàng)目檢測(cè)的試劑盒，不同廠家提供的試劑線性范圍與試劑的質(zhì)量有直接關(guān)系。但絕大部分試劑盒所含的底物濃度在一般情況下是足夠大的，可以滿(mǎn)足絕大多數(shù)臨床標(biāo)本的實(shí)際檢測(cè)需要。但當(dāng)人體肝臟、心臟等損傷特別嚴(yán)重時(shí)，ALT、AST、CK等酶的釋放會(huì)使得血中的濃度大幅度上升，樣本中酶的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于試劑檢測(cè)的線性范圍，也就是零級(jí)反應(yīng)期非常短，不能完成正常的速率法檢測(cè)，此時(shí)的檢測(cè)是無(wú)效的，不準(zhǔn)確的。如圖六，反應(yīng)曲線示意圖中紅色虛線，底物耗盡樣本的反應(yīng)曲線。

圖六 反應(yīng)曲線示意圖

當(dāng)發(fā)生底物耗盡時(shí)，日立生化分析儀會(huì)有對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)報(bào)警符號(hào)（Limt0/Limt1/Limt2，在測(cè)定結(jié)果后面顯示分別對(duì)應(yīng)的”I”、”J”、”K”），提示數(shù)據(jù)異常。

上文案例中，患者ALT結(jié)果是負(fù)值，而且有既往結(jié)果，引起了檢驗(yàn)科大夫的重視。試想，假設(shè)在測(cè)光區(qū)域有一點(diǎn)變化，結(jié)果不是負(fù)值，而且也沒(méi)有既往結(jié)果，很有可能會(huì)將錯(cuò)誤的結(jié)果發(fā)出去。為了防止這種現(xiàn)象發(fā)生，日立所有的機(jī)型都具備底物耗盡監(jiān)測(cè)和報(bào)警的功能。當(dāng)然，合適的參數(shù)設(shè)置極其重要，例如，對(duì)于反應(yīng)過(guò)程吸光度呈升高的酶類(lèi)項(xiàng)目，我們應(yīng)該在參數(shù)設(shè)置畫(huà)面設(shè)置合理的高限值（Abs.limit）；相反，對(duì)于吸光度呈下降趨勢(shì)的項(xiàng)目，應(yīng)該設(shè)置合理的低限值（Abs.limit）。同時(shí)，我們?cè)谶x擇試劑時(shí)，一定要注意試劑本身的質(zhì)量，認(rèn)真評(píng)估試劑的線性范圍。

對(duì)于底物耗盡的監(jiān)測(cè)需要合理的參數(shù)設(shè)置，以及儀器的報(bào)警提醒。相比而言，底物耗盡的處理卻是很簡(jiǎn)單的，只需要用生理鹽水（或去離子水）進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)缓蟪艘韵鄳?yīng)稀釋倍數(shù)即可。值得一提的是，稀釋并不是無(wú)限制的，稀釋倍數(shù)越大引起的誤差可能就越大，需要對(duì)試劑最大稀釋倍數(shù)進(jìn)行有效評(píng)估。

（筆者：權(quán)國(guó)強(qiáng)）

參考資料

[1] 閆家微，張啟全，成松，全自動(dòng)生化分析儀ALT底物耗盡現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和解決。國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2011年9月第32卷第14期。

[2]劉成，劉愛(ài)華，生化分析儀檢測(cè)酶活性過(guò)程中底物耗盡的監(jiān)測(cè)和處理。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床2011年2月第8卷第4期。

[3]岳展伊，唐古生，杜大海，王學(xué)，李聞捷，張建榮，全自動(dòng)生化分析儀監(jiān)測(cè)酶活性過(guò)程中得底物耗盡的監(jiān)測(cè)和處理。國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2010年4月第31卷第4期。

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