本文發(fā)現(xiàn)

1：PVT1啟動子沉默會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖

2：PVT1啟動子能夠抑制MYC的轉(zhuǎn)錄

3：PVT1和MYC的啟動子的活性相互競爭

1：PVT1 CRISPRi促進(jìn)細(xì)胞增殖

  首先研究者證明PVT1 CRISPRi會導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快，具體說來是針對PVT1的前兩個TSSs（TSS1和2）區(qū)域的sgRNA（Fig.1A, S1A-C）。這其中，針對TSS1的CRISPRi有著更明顯的促進(jìn)增殖的效果（Fig.1B，S1C-D），因此研究者接下來分析了TSS1處的區(qū)域，稱為PVT1的啟動子。CRISPRi-PVT1的細(xì)胞增殖遠(yuǎn)快于對照的CRISPRi-LacZ細(xì)胞，并能夠形成更大的克隆、和更多的衛(wèi)星克隆（Fig.1C-D）。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了同樣的結(jié)果（Fig.1E），以上數(shù)據(jù)說明PVT1 promoter的敲除呈現(xiàn)出與前人報(bào)道相反的結(jié)果（PVT1是原癌基因）。

Figure 1

Figure S1

2：PVT1啟動子敲除促進(jìn)MYC表達(dá)水平

通過RNA測序，研究者發(fā)現(xiàn)PVT1啟動子敲除的細(xì)胞中MYC水平劇烈上升（Fig.2A）,，MYC蛋白水平也同時升高（Fig.2B）。研究者進(jìn)一步在PVT1啟動子上，即TSS1前后各設(shè)計(jì)一系列的sgRNAs，發(fā)現(xiàn)只有針對TSS1位點(diǎn)后面的sgRNAs才能夠抑制PTV1的水平、并提高M(jìn)YC表達(dá)（Fig.2C）。在PVT1 CRISPRi的細(xì)胞中再敲低MYC表達(dá)，能夠抑制其增殖（Fig.2D-E）；并且PVT1和MYC的表達(dá)呈現(xiàn)了明顯的負(fù)相關(guān)（Fig.2F），說明PVT1敲除后的過度增殖表型可能是由于其對MYC水平的促進(jìn)造成的。

Figure 2

3: PVT1 locus對MYC的調(diào)控不是由其lncRNA序列本身促進(jìn)的

接下來研究者分析了PVT1 lncRNA本身對于MYC表達(dá)調(diào)控是否有影響，有趣的是發(fā)現(xiàn)降低其編碼序列本身并不會減少M(fèi)YC的表達(dá)（Fig.3A-C）。

Figure 3

4：PVT1上的DNA元件能夠抑制MYC轉(zhuǎn)錄和表達(dá)

通過Hi-ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MYC和PVT1位于同一個TAD結(jié)構(gòu)上（Fig.4A）。并且MYC水平受到PVT1上的啟動子、和內(nèi)含子上的增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)共同調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)在PVT1的水平能夠受到兩者的抑制（Fig.4A-C）。作為證據(jù)，研究者進(jìn)一步觀察了能夠啟動轉(zhuǎn)錄的BRD4、以及Pol II再M(fèi)YC和PVT1上的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)CRISPRi-PVT1能夠抑制PVT1轉(zhuǎn)錄的同時，促進(jìn)MYC的轉(zhuǎn)錄（Fig.4D-F）。

Figure 4

5: PVT1啟動子對于MYC轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)是可逆的

研究者構(gòu)建了利用CRISPR技術(shù)過表達(dá)的CRISPRa-PVT1，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)PVT1表達(dá)的同時抑制MYC（Fig.5A-B），并且抑制BRD4和Pol II在MYC上的結(jié)合（Fig.5C-F）。與此同時，CRISPRi-MYC抑制MYC的表達(dá)能反過來促進(jìn)PVT1的表達(dá)（Fig.5G），綜合以上結(jié)果，PVT1和MYC的啟動子存在競爭作用（Fig.5H）。

Figure 5

6：PVT1啟動子能夠調(diào)控同一染色體上的MYC表達(dá)

在以往的報(bào)道中，PVT1 lncRNA的功能主要集中在結(jié)合RNA結(jié)合蛋白以及其他調(diào)控型RNA。研究者巧妙的利用129S1和Castaneous小鼠的F1代雜合子分離出單細(xì)胞，培養(yǎng)和分化并進(jìn)行ATAC和ChIP測序分析(Fig.6A)，發(fā)現(xiàn)如下：

1）mESC中兩個親本來源的PVT1都會表達(dá)(Fig.6B)

2）分化后（mNPC）僅有其中一條染色體上的PVT1表達(dá)(Fig.6B)

3）表達(dá)PVT1的那條染色體上，MYC的表達(dá)受到抑制（Fig.6B-C），并且MYC和PVT1的表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(Fig.6D-E)

Figure 6

7：腫瘤病人中存在許多PVT1啟動子上的突變

通過分析已有的腫瘤病人測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PVT1 locus附近存在大量突變、大片段缺失等，尤其是在其TSS附近（Fig.7A-D）。研究者進(jìn)一步利用CRISPR編輯附近的序列，發(fā)現(xiàn)突變細(xì)胞增殖速度更快（Fig.7E），且細(xì)胞中的MYC水平更高（Fig.7F）

Figure 7

討論：

PVT1是首個報(bào)道與腫瘤相關(guān)的lncRNA，是一個原癌“基因”，并且在腫瘤病人中可見突變。本研究并未局限于lncRNA本身的功能，而是利用其在基因組上與MYC相鄰的位置特點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了在DNA序列水平上PVT1對MYC表達(dá)的直接調(diào)節(jié)，證明了PVT1序列水平上對于MYC表達(dá)的抑制作用、以及腫瘤發(fā)生的抑制作用。

文章來源

Seung Woo Cho, et al. (2018). Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell 173, 1-15.

Reference:

1. Dixon, J.R., Selvaraj, S., Yue, F., Kim, A., Li, Y., Shen, Y., Hu, M., Liu, J.S., and Ren, B. (2012). Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485, 376–380.

2. Schmitt, A.M., and Chang, H.Y. (2016). Long noncoding RNAs in cancer pathways. Cancer Cell 29, 452–463.

3. Tseng, Y.Y., Moriarity, B.S., Gong, W., Akiyama, R., Tiwari, A., Kawakami, H., Ronning, P., Reuland, B., Guenther, K., Beadnell, T.C., et al. (2014). PVT1 dependence in cancer with MYC copy-number increase. Nature 512, 82–86.