Tunel法常用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其原理為細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，相關(guān)DNA內(nèi)切酶會(huì)被激活，從而切斷核小體間的DNA。在細(xì)胞凋亡晚期，DNA會(huì)被降解為180-200 bp的片段。TdT介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TUNEL）是在TdT的催化下將熒光素標(biāo)記的dUTP與斷裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

Tunel試劑盒適用于組織樣本（石蠟切片、冰凍切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。今天就為大家介紹三種樣品的處理方法：

一.石蠟切片

1）脫蠟與水化：將切片依次放入二甲苯I（15min）→二甲苯II（15min）→100％乙醇（5min）→95％乙醇（5min）→90％乙醇（5min）→85％乙醇（5min）→80％乙醇（5min）→70％乙醇（5min）→ddH2O沖洗5min，重復(fù)3次；
2）用組化筆圈好組織，在每個(gè)樣品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；
3）1×PBS洗5min，3次，洗凈PK；

二.冰凍切片

1）1×PBS洗5min，3次。
2）用組化筆圈好組織，在每個(gè)樣品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；
3）1×PBS洗5min，3次，洗凈PK；

三.細(xì)胞涂片：

1）固定細(xì)胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。
2）洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5min。重復(fù)用PBS洗一次。動(dòng)作要輕柔，防止細(xì)胞脫片。
3）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。
4） 每個(gè)樣本上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用5min；
5）1×PBS洗5min，3次，洗凈PK；

三種樣品處理的方法略有不同，最關(guān)鍵的差別在于蛋白酶(PK）的處理時(shí)間，一般組織樣品處理的時(shí)間略長(zhǎng)，細(xì)胞處理時(shí)間最好控制在幾分鐘內(nèi)，防止樣品通透過(guò)度，造成組織或細(xì)胞脫片。樣品處理好之后，后續(xù)的陽(yáng)性對(duì)照處理與檢測(cè)方法相同，即：

1）陽(yáng)性對(duì)照制備：按1:10的比例用ddH2O稀釋10×DNase I Buffer，取其中100μl滴加到已通透的樣本上，室溫孵育5min。向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I(1U/μl)。洗掉液體，加入100μl含DNase I的緩沖液，室溫孵育10min。洗掉液體，并將載玻片放入1×PBS洗5min，3次；
2）按1:5的比例用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer。將四組樣本分別滴加100μl 1×Equilibration Buffer覆蓋樣本，室溫孵育10-30min；
3）Tunel檢測(cè)液按照下列表格配制，檢測(cè)液需充分混勻。陰性對(duì)照組配制過(guò)程中不加TdT酶的對(duì)照孵育緩沖液，用ddH2O替代TdT酶；

試劑    體積（50μl）
ddH2O    34μl
5×Equilibration Buffer    10μl
FITC-12-dUTP Labling Mix    5μl
Recombinant TdT Enzyme    1μl

4）將載玻片上的100μl 1×Equilibration Buffer洗掉，再加入50μl TdT孵育緩沖液；
5）將載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃避光孵育60min，后續(xù)步驟注意避光操作；
6）1×PBS洗5min，重復(fù)一次；
7）輕輕擦掉樣本周?chē)氨趁娴腜BS溶液。為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗5min，3次；
8）向玻片上滴加DAPI避光孵育5-10min，復(fù)染細(xì)胞核；
9）1×PBS 洗5min，3次，洗去多余的DAPI；
10）用吸水紙吸干玻片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片；
11）共聚焦熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。