意義未明的變異嚴重的限制了遺傳學信息知識的臨床使用，其面臨的挑戰(zhàn)在BRCA1基因上顯現(xiàn)出來了。BRCA1基因作為腫瘤抑制因子，發(fā)生在該基因上的胚系功能缺失型突變能導致婦女患上乳腺癌，卵巢癌。雖然許多婦女都進行了BRCA1基因的測序，但是許多新發(fā)現(xiàn)的變異的致病風險無法評估。本文使用了飽和基因編輯（SGE）的方法，從BRCA1基因編碼關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)區(qū)域的13個外顯子中的所有可能的SNV中選擇了96.5%進行了處理。近4000個SNV的功能效果呈現(xiàn)雙峰分布，這和已有的致病性評價幾乎一致。超過400個非功能性（針對細胞存活的意義而言，有害變異導致BRCA1基因不能發(fā)揮抑癌作用，使得細胞更易凋亡，是為非功能）錯義突變被鑒定出來，300個SNV擾亂了基因表達，作者認為這些實驗結(jié)果很快會對BRCA1的臨床應(yīng)用產(chǎn)生用途，也可延伸用于其他基因的類似意義未明變異問題。

眾所周知，目前醫(yī)學上預(yù)測人類基因組上的任意遺傳突變導致的表型結(jié)果能力還是較差的，這個問題在遇到大量的意義未明變異時表現(xiàn)得更明顯。因此，發(fā)生在某個基因上確定意義的致病突變在臨床管理上意義巨大。比如，發(fā)生在BRCA1基因上的雜合突變顯著增加了乳腺癌早期和卵巢癌早期的患病風險 ，但是這一突變明顯又是可控的，因為多次數(shù)的篩查或者預(yù)防藥物治療有利于改善結(jié)果。但是至今為止的許多BRCA1基因的SNV都被定義為意義未明，所以進一步解釋這些變異是迫切的。

常見的解決意義未明變異（VUS）的兩條主要途徑是：數(shù)據(jù)共享，這是由于許多復發(fā)變異在多個個體都有檢出，便可以借鑒檢出突變個體的癌癥發(fā)展情況來分析該變異情況，但是存在BRCA1基因大多數(shù)變異都是罕見變異和BRCA1基因的不完全外顯的情況。因為BRCA1基因的同源DNA修復（HDR）是基因發(fā)揮腫瘤抑制功能的關(guān)鍵，所以BRCA1基因變異是否恢復它的同源DNA整合能力是一個常見的檢測標準。還有其他的檢測比如評價胚胎干細胞生存能力，轉(zhuǎn)錄激活能力，藥物敏感性，蛋白互作用等。但是功能實驗評價BRCA1變異也存在一些限制。比如功能實驗驗證落后于VUS的發(fā)現(xiàn)；用于表達變異的cDNA轉(zhuǎn)基因體脫離了基因組環(huán)境，不能檢測剪接效果或轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性，有人工表達體過表達的風險。而借助基因編輯技術(shù)，可以克服這些挑戰(zhàn)。而且目前這一技術(shù)還沒運用于像BRCA1基因等和癌癥易感相關(guān)的基因。有鑒于此，本文對BRCA1基因關(guān)鍵的13個外顯子涉及的3893個SNV(約占96.5%)進行了飽和基因編輯，以分析BRCA1基因的變異的功能結(jié)果并用于后續(xù)基因檢測。

BRCA1基因的飽和基因編輯

在人類單倍體細胞系HAP1中，參與同源DNA修復（HDR）的許多基因像BRCA1,BRCA2等是非常重要的（圖1a），作者用Cas9和gRNAs靶定位這些基因做了一個質(zhì)粒共表達實驗，然后轉(zhuǎn)染HAP1細胞，驗證了這些基因發(fā)生變異會導致HAP1細胞存活力下降并最終大量死亡的現(xiàn)象，確定了參與HDR途徑的基因成分在HAP1細胞中的重要性，圖1a中標紅色的基因就是實驗中證明在HAP1細胞系中地位重要的基因（也即HAP1必須基因），并且在圖中進行了放大展示。接下來是構(gòu)建和優(yōu)化用于SGEs的文庫(圖1b)，這是用于在細胞系中引入BRCA1基因13個外顯子的所有可能的SNVs（RING結(jié)構(gòu)區(qū)，外顯子2-5，BRCT結(jié)構(gòu)區(qū)，外顯子15-23）。使用芯片合成的寡核苷酸庫（囊括13個外顯子和外顯子外面內(nèi)含子10bp）,寡核苷酸庫里的變異都經(jīng)由同源臂克隆到質(zhì)粒上。當然，每一個寡核苷酸在Cas9靶位都設(shè)計了用于在HDR成功后減少重復剪切的同義甲氨基取代。一個SGEs實驗對應(yīng)一個外顯子。共計2千萬個在HAP1細胞day0（作者自定義，開始轉(zhuǎn)染的當天）進行SNV文庫，Cas9/gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在day5和day11收集編輯過得外顯子靶向gDNA和 RNA測序用于后續(xù)量化變異頻率。為了獲得更多詳細的數(shù)據(jù)。作者用單克隆LIG4-敲除HAP1細胞系和對1n倍數(shù)HAP1細胞排序來優(yōu)化SGE流程。除此之外，作者還使用靶向RNA測序來決定大量發(fā)生在BRCA1基因mRNA的SNV。

圖1

對BRCA1基因的3893個SNV進行功能性打分

為了計算每個SNV的功能打分，首先計算day11（day11是從相對于進行SNV文庫，Cas9/gRNA質(zhì)粒和HAP1細胞共轉(zhuǎn)染實驗的當天為day0來計算的，下同）的SNV的頻率比上該SNV在質(zhì)粒文庫的頻率，然后計算log2 值；其次，使用day5的SNV頻率構(gòu)建了編輯速率的位置偏好性模型。再其次，為了不同外顯子能進行比較，對功能打分進行了歸一化。最后，一小部分分數(shù)可信度較低的被過濾掉。

功能打分呈雙峰分布（圖2d），無義突變位于-1.25分以下，98.7%的同義SNV距離剪接連接處3bp以上距離的打分都在-1.25分以上，作者借助二元高斯混合模型把所有的SNV分類為功能性，非功能性，中間型，最終72.5的SNV,定義為功能性，21.1%定義為非功能性，6.4%定義為中間型。非功能性分布定義為跨越所有外顯子的無義突變，功能性分布定義為外顯子區(qū)間的同義突變，且不是位于剪接連接區(qū)域的3bp以內(nèi)，RNA分值在中位數(shù)同義SNV的1個SD以內(nèi)。

圖2

然而SNVs擾亂了經(jīng)典剪接位點卻大多數(shù)都是非功能性(89.5%)或中間型(5.5%)。SNVs位于外顯子內(nèi)部1-3bp或內(nèi)含子3-8bp效果不一樣，其中22.9%是非功能性的，SNVs位于深度內(nèi)含子區(qū)域或5`UTR區(qū)域功能結(jié)果與非剪接區(qū)域同義SNVs類似，不大可能是非功能變異（包括：內(nèi)含子，1.8%；5`UTR，0.0%；同義，1.3%）

功能性打分準確預(yù)測致病性

作者調(diào)查了功能性分值與Clinvar的一致性問題。在169個SNV中，162個被定義為非功能性，2個被定義為功能性，剩下的被定義為中間型。相反，Clinvar中22個良性SNV，20個被定義為功能性，1個被定義為非功能性，1個定義為中間型（圖3a）ROC曲線顯示在處理Clinvar注釋的致病和良性變異時，特異性為98.2%，敏感性為96.7%（圖3b）。對25% (64 out of 256)VUS和49.2% (60 out of 122)解釋矛盾的SNV進行打分（圖3c），Clinvar注釋的錯義VUS比Clinvar里缺失的錯義SNV更大可能打分為非功能，3140個Clinvar里缺失的SNV中498個打分為非功能。對比人群數(shù)據(jù)庫，在302個與gnomAD重疊的SNV中，更高的等位基因頻率意味著更高的功能得分（補充材料8a）。類似地，在39個與FLOSSIES數(shù)據(jù)庫（1萬個歲數(shù)大于70歲，無罹患乳腺癌或卵巢癌）交叉的SNV中，只有一個打分為非功能性。總之，這都表明BRCA1 SNV有著高頻率的話更可能打分為功能性。生物軟件矩陣CADD, phyloP 和Align-GVGD的評價結(jié)果比起SGE功能打分則遜色多了（圖3d）。

圖3

BRCA1缺失性功能機制

對day5的細胞進行BRCA1轉(zhuǎn)錄本的RNA測序，發(fā)現(xiàn)89%的非功能性錯義SNV大體上在RNA水平?jīng)]有減少，表明它們可能是通過調(diào)節(jié)蛋白水平發(fā)揮作用（圖5a）。許多基團對不影響RNA水平的錯義SNV敏感，而它們都位于掩埋的疏水基團或RING域折疊所需的鋅配位環(huán)（圖5b,c）。作者也對許多影響表達的SNV采用SGE進行了研究，所有的SNV擾亂翻譯起始密碼子的都是非功能的，一些位于-3，+4，+5位置的SNV預(yù)測出減少了翻譯起始效率則也打分為中間型或非功能性。此外，11%的非功能錯義突變導致了RNA水平至少75%的減少，許多都位于非結(jié)構(gòu)區(qū)域（圖5b,5c）。表明缺失性功能導致的是減少mRNA水平而不是擾亂蛋白水平。

圖4

圖5

導致RNA缺失的變異可能影響RNA編輯。因為靠近剪接位點處的非功能外顯子SNV明顯比例過高，包括外顯子末端G核苷酸的SNV打分較低（圖4）。mRNA水平較低的非功能性外顯子SNV創(chuàng)造了了新的受體或供體位點（圖5d），也存在一個人6-8bp區(qū)域里面的許多SNV對mRNA水平有較大的影響，暗示了這可能是外顯子剪接增強子。有些外顯子傾向產(chǎn)生較低RNA打分的非功能性SNV，比如外顯子16里面的46/244個SNV（排除無義突變）都是非功能性的。大多數(shù)的都是減少了2倍以上的RNA水平，15個減少了4倍以上。相反，19外顯子中，55/234個SNV排除無義突變）也是非功能性的，但是沒有一個降低了2倍以上的表達，而且外顯子19的側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域完全沒有非功能性SNV，暗示它可能可以粗糙的剪接。

SGE方法對于確定SNV的致病性有很高的特異性和敏感性，而且較之生物軟件矩陣預(yù)測有著更高的準確性，比ClinVar判定結(jié)果精確度要高，有利于處理證據(jù)沖突的變異。同時也能為non-Clinvar變異，人群數(shù)據(jù)庫缺失的變異，和缺少遺傳學證據(jù)的變異進行解釋。未來可以用SGE研究,PALB2, BARD1等與人體易患腫瘤相關(guān)的基因，在一定范圍縮小SGE范圍也便于理解基因組編碼的生物功能多樣性。最后，作者希望功能打分能為數(shù)以百計的BRCA1模糊的變異以及新發(fā)現(xiàn)的變異提供有用的解釋。本文也許可以作為對有潛在意義的SNV在臨床上的應(yīng)用需要的綜合功能分析的藍圖。

因為本研究使用的HAP1細胞系進行的研究，以后如果更合適的情況下可以把基因編輯的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入哺乳動物體內(nèi)研究，這樣的研究結(jié)果更可靠（當然對于大批量的基因編輯實驗不太合適）。文章主要是使用Clinvar數(shù)據(jù)庫，人群數(shù)據(jù)庫，生物軟件預(yù)測進行了對比，建議可以再加上人工二次校對后的HGMD數(shù)據(jù)庫。而且文章的研究對象主要局限于SNV，加上indel，CNV等也是很有前景的研究方向。另外就是希望SGE技術(shù)可以盡快使用到包括遺傳性腫瘤等孟德爾病等領(lǐng)域，造福臨床治療。當然，或許對于體細胞變異危害性的研究也有一定借鑒意義。

參考文獻：

[1] Lea M. Starita, Jay Shendure et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature, 2018,562: 217–222.