只做了測序，沒做其他實(shí)驗(yàn)，還能發(fā)Cell？大佬，你是如何做到的？

不用說，肯定是生信分析，這次 Iasia依舊延續(xù)“實(shí)例講分析”的方式邊講文獻(xiàn)邊講分析。

今天要講的這篇文獻(xiàn)，底部一定會有人留言：

（沒想到吧，老師是會看留言的，有問題也可以向老師留言啊~）

確實(shí)，有投入才會有回報(bào)，當(dāng)然是多樣本才更有說服力，才能有更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘。但這并不是因果關(guān)系，有了大樣本可不一定就能發(fā)高分文章。

況且對于這個水平的文章來說，101例樣本絕對不算多。再加上完全不用做實(shí)驗(yàn)，只需要做測序與分析，不知道節(jié)省了多少時間與精力。

本篇文章在如何分析上做出了比較好的示范，大家可以仔細(xì)感受一下。

有經(jīng)費(fèi)、有樣本的大佬，可以考慮“搞個大新聞”。

一般的研究生、博士生是沒有這么多經(jīng)費(fèi)投入了，只能說：先收藏學(xué)習(xí) or 請轉(zhuǎn)給老板看。

（時間預(yù)警：內(nèi)容很長、慢慢閱讀）

文章標(biāo)題：Genomic Hallmarks and Structural Variation inMetastatic Prostate Cancer

影響因子：31.398

中科院分區(qū)：1區(qū)

發(fā)表時間：July 19, 2018

DOI：https:///10.1016/j.cell.2018.06.039

?101個前列腺癌轉(zhuǎn)移的深度全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序

?串聯(lián)重復(fù)影響AR和MYC的基因間調(diào)控基因座

?CDK12，TP53和BRCA2的失活影響不同類型的結(jié)構(gòu)變異

?雄激素受體受到85％mCRPC突變或結(jié)構(gòu)變異的影響

1. 前列腺癌是一種常見的臨床異質(zhì)性腫瘤，但只有不到20%的患者會發(fā)展成一種致命的前列腺癌，被稱為去勢抵抗性前列腺癌(mCRPC)。

   
   

2. 研究mCRPC的一個主要障礙是很難獲得轉(zhuǎn)移性病灶。mCRPC最近通過靶向捕獲或全外顯子組測序評估發(fā)現(xiàn)了AR信號通路、DNA修復(fù)、 PI3K信號通路的改變，以及SPOP、FOXA1和IDH1等基因的復(fù)發(fā)突變。

   
   

3. 然而，外顯子代表了<>

   
   

研究者選取了運(yùn)用雄激素剝奪療法（ADT）進(jìn)行一線治療后產(chǎn)生抵抗力的101位前列腺患者，進(jìn)行了全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序（覆蓋范圍：109X腫瘤/38X正常），然后進(jìn)行整合性全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了改變腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)變異，但是這些調(diào)控因子不能用外顯子測序方法檢測到。

值得注意的是，研究者觀察到雄激素（AR）上游624 kb的一個基因間增強(qiáng)子區(qū)域的擴(kuò)增在81%的患者中，并且與AR表達(dá)上調(diào)相關(guān)。串聯(lián)重復(fù)熱點(diǎn)也出現(xiàn)在MYC附近，在與翻譯后MYC調(diào)控相關(guān)的lncrna中。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷修復(fù)的缺陷容易導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變異，比如CDK12突變與串聯(lián)重復(fù)、TP53失活與倒置重排和染色體碎裂的聯(lián)系，以及BRCA2失活與缺失的聯(lián)系。值得注意的是，大部分的SV都位于基因組間或非編碼的內(nèi)含子區(qū)，并沒有被外顯子組測序或轉(zhuǎn)錄組分析所捕獲。與外顯子組測序相比，全基因組測序(WGS)的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是，WGS能夠識別改變關(guān)鍵驅(qū)動基因、腫瘤抑制因子和調(diào)控因子活性的SV。

基因組結(jié)構(gòu)變異SV包括基因組缺失、插入、串聯(lián)重復(fù)、倒置重排和染色體間易位。SV在前列腺癌中普遍存在，在40%-60%的病例中發(fā)現(xiàn)了涉及E26特定轉(zhuǎn)換(ETS)轉(zhuǎn)錄因子家族的基因融合。最近一項(xiàng)針對部分前列腺癌的研究顯示，在5%-6%的樣本中都有基因組重排。此外，先前的研究已經(jīng)證實(shí)SV可以定義卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌的亞型。值得注意的是，大部分的SV都位于基因組間或非編碼的內(nèi)含子區(qū)，并沒有被外顯子組測序或轉(zhuǎn)錄組分析所捕獲。與外顯子組測序相比，全基因組測序(WGS)的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是，WGS能夠識別改變關(guān)鍵驅(qū)動基因、腫瘤抑制因子和調(diào)控因子活性的SV。

為了全面研究mCRPC的基因組驅(qū)動因素，研究者對100多位腫瘤患者的mCRPC樣本進(jìn)行了全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測序，平均深度為109X，是以往大型癌癥WGS研究的2-3倍。對一個大的患者隊(duì)列進(jìn)行深度測序，使其能夠發(fā)現(xiàn)新的復(fù)發(fā)性SV，并確定mCRPC中這些變異的患病率。

研究者發(fā)現(xiàn)了以前未知的復(fù)發(fā)性SV調(diào)控腫瘤抑制因子或癌基因，發(fā)現(xiàn)了將非編碼基因與已知的腫瘤驅(qū)動基因結(jié)合在一起的新重組，并發(fā)現(xiàn)了DNA修復(fù)改變與SV之間新的關(guān)聯(lián)。

一個多機(jī)構(gòu)的聯(lián)盟進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性IRB批準(zhǔn)的研究(NCT02432001)，該研究獲得并描述了前列腺癌患者去勢抵抗性轉(zhuǎn)移性腫瘤活檢。獲得圖像引導(dǎo)的核心活組織切片，并進(jìn)行新鮮冷凍，采用激光帽狀顯微解剖分離富集的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行RNA測序。

全基因組DNA測序是在冷凍切片上進(jìn)行的，用于腫瘤和外周血的匹配正常樣本，獲得腫瘤的平均深度為109X，正常樣本為38X，包括101例患者的結(jié)果，包括骨(n = 42)、淋巴結(jié)(n = 40)、肝臟(n = 11)或其他軟組織部位(n = 8)的mCRPC病灶。

研究者的mCRPC腫瘤基因組拷貝數(shù)改變的頻率與以前的外顯子組測序報(bào)告一致。每個樣本中DNA變異的百分比在7%到47%之間(中間值23%)。中值突變頻率為4.1突變/Mb，略低于mCRPC之前報(bào)告的4.4突變/Mb，但大于原發(fā)性前列腺癌的0.53突變/Mb。約40%的腫瘤為三倍體大多是易位和突變。

研究者系統(tǒng)地識別基因組結(jié)構(gòu)變異影響的區(qū)域中，最頻繁的位點(diǎn)包含前列腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動基因，強(qiáng)調(diào)了該疾病中構(gòu)建結(jié)構(gòu)變異的重要性。這包括AR、TMPRSS2和ETS轉(zhuǎn)錄因子(ERG)基因，它們產(chǎn)生TMPRSS2/ERG融合蛋白、癌基因MYC、FOXA1、磷酸酶和PTEN。

圖1 

對SV和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)SV使腫瘤抑制因子失活。36%的腫瘤受到雙等位基因改變的影響，26%的腫瘤受到單等位基因改變的影響(圖2)。PTEN序列或啟動子經(jīng)常被易位(7%的病例)或重排(5%的病例)中斷。而其他腫瘤的驅(qū)動因子如TP53、CDKN1B、RB1和CHD1的失活等位基因數(shù)量和mRNA水平之間存在顯著的聯(lián)系 (圖2，右)，表明單等位基因的改變影響了這些基因的表達(dá)水平。

圖2

通過整合SV數(shù)據(jù)、mRNA表達(dá)水平和預(yù)測mRNA融合，確定了結(jié)構(gòu)變異被預(yù)測激活驅(qū)動基因的情況。在的隊(duì)列中有59%的人(圖3)激活了ETS家族成員ERG、ETV1、ETV4和ETV5。

在四種情況下，ETS家族成員融合到以前在mCRPC中沒有報(bào)道過的基因，包括由溶質(zhì)載體SLC30A4和ETV4融合驅(qū)動的ETV1融合，以及TMCC2、CLTC和CDC6驅(qū)動的ETV4融合。

研究者還發(fā)現(xiàn)了編碼基因和非編碼基因之間的新融合，SCHLAP1是lncRNA，在一組侵襲性前列腺癌中高度富集。

研究這還注意到包括AXL、BRAF和MYC在內(nèi)的多個涉及癌基因的低頻基因融合(圖1E和S3B)?；蛉诤蠈⑶傲邢偎崃姿崦?ACPP)殘基380 (NM_001009)與殘基429 (NM_001699)的跨膜受體酪氨酸激酶AXL結(jié)合，產(chǎn)生一個幀內(nèi)轉(zhuǎn)錄本。這些新型的低頻基因融合可以代表mCRPC的治療靶點(diǎn)。

圖3

基因組擴(kuò)增事件是基因組進(jìn)化的一種機(jī)制，可以改變癌癥中重要的特定驅(qū)動基因，如急性髓細(xì)胞白血病的FLT。

無偏分析確定AR上游624kb區(qū)域?yàn)閙CRPC結(jié)構(gòu)變化最頻繁的區(qū)域。70%的病例出現(xiàn)AR擴(kuò)增，且與顯著升高的AR mRNA表達(dá)相關(guān)。這些結(jié)果與早期的發(fā)現(xiàn)一致，即AR擴(kuò)增在原發(fā)性前列腺癌中是罕見的，但在mCRPC中很常見，是抗雄激素剝奪治療的主要機(jī)制。MYC拷貝數(shù)擴(kuò)增程度與MYC mRNA表達(dá)水平有一定的相關(guān)性

這些觀察結(jié)果共同證明了全基因組測序?qū)Υ?lián)重復(fù)的無偏分析，確定了在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中驅(qū)動基因的位點(diǎn)，如AR、MYC和FOXA1，他們會導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。

圖4

為了探討SV在前列腺癌中的病因，研究者首先統(tǒng)計(jì)了SV頻率。SV在個體腫瘤的發(fā)生數(shù)量介于103和923之間(圖5 a)。在雙等位基因BRCA2突變的腫瘤中基因片段缺失明顯更高 (圖5B，左)。

此外，還觀察到CDK12的雙等位基因失活與串聯(lián)重復(fù)顯著增加(圖5B中心，5C) 。雙等位基因TP53失活與倒置重排頻率升高及染色體存在顯著相關(guān)。BRCA2丟失與腫瘤突變負(fù)擔(dān)的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性最強(qiáng)(平均7.0和4.0突變/Mb, p = 0.0002，圖5E)。

因此，分析發(fā)現(xiàn)，CDK12、BRCA2和TP53的雙等位基因失活與mCRPC中的三種SV形式密切相關(guān)，而TP53失活與倒置重排有關(guān)，進(jìn)一步引起染色體斷裂。

圖5

帶有同源重組修復(fù)缺陷的細(xì)胞會產(chǎn)生基因組疤痕(Lord和Ashworth, 2016)，包括刪除區(qū)域兩端的同源缺失。這些細(xì)胞依靠微同源介導(dǎo)的末端連接來修復(fù)雙鏈DNA斷裂，也稱為選擇性非同源末端連接。帶有BRCA2雙等位基因缺失的腫瘤具有微同源性的缺失水平(圖6A)。

圖6

圖7

我們將已發(fā)表的突變特征與體細(xì)胞變異進(jìn)行比較。使用非負(fù)矩陣分解來分析樣本中特有的突變特征，從中發(fā)現(xiàn)特征8與雙等位基因BRCA2失活的樣本密切相關(guān)(圖6A和7A)，與COSMIC 3，8非常相似(圖6A和7B)，與同源重組DNA修復(fù)(HRD)缺陷相關(guān)。

這些數(shù)據(jù)證實(shí)了錯配修復(fù)和同源重組中的DNA修復(fù)缺陷可以在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中產(chǎn)生基因組疤痕，并表明BRCA1/2復(fù)合雜合性產(chǎn)生了一個與雙等位BRCA2失活不同的突變表型。

 最后，簡單總結(jié)一下這篇文章里用到的分析策略：DNA SV分析、融合基因分析  CNV分析、微同源缺失的評估、chromothripsis and chromoplexy 的評估、突變特征分析 、非編碼基因的突變分析。

Iasia讀這篇文章最大的感受就是：idea?？梢钥闯鲞@篇文章的作者對自己研究的內(nèi)容在行業(yè)內(nèi)的研究情況有著深刻的認(rèn)知，對自己接下來要如何研究有著清晰的規(guī)劃。“套路終究抵不過真情”，再多的套路都敵不過扎實(shí)的知識積累。

本篇文章并沒有用特別新的技術(shù)，就是用全基因組測序（文中有說明原因）對全基因組進(jìn)行生信分析，加上轉(zhuǎn)錄組測序驗(yàn)證。這是由于作者對自己的研究對象有著非常清晰的認(rèn)識，而后選擇了最合適的方法。

高分文章與大樣本聯(lián)合起來算是比較常見的搭配，但并非有了大樣本就能發(fā)文章，用了新技術(shù)就能發(fā)高分文章，花了許多經(jīng)費(fèi)、做了大量實(shí)驗(yàn)就能發(fā)高分文章。Iasia有遇到一些客戶，手里有幾百例樣本打算做測序、做分析，但他對自己研究的疾病在行業(yè)內(nèi)已經(jīng)被研究到了什么程度一無所知，自己的研究策略也比較模糊，手握大量樣本也很難做出出色的結(jié)果。