1.本文是首次報(bào)道通過大人群測序闡明肝癌早期患者腸道微生物的特性。2.腸道微生物的改變可能導(dǎo)致個(gè)體肝癌的形成，這暗示借助改變腸道微生物的方法，即通過腸道-微生物-肝這一軸線來防止肝癌的發(fā)展。3.本文也是首次報(bào)道成功建立了肝癌的診斷模型和驗(yàn)證了跨區(qū)域的肝癌微生物標(biāo)記（中國三個(gè)不同的區(qū)域），腸道微生物-靶向標(biāo)記代表了一種有潛力的肝癌早期診斷的無創(chuàng)工具。

肝癌是世界范圍內(nèi)引起人類死亡的第三大癌種，主要原因是乙肝病毒的持續(xù)感染和乙肝病毒誘導(dǎo)的肝硬化。因?yàn)槿狈Ω伟┰缙陔A段的特異性癥狀和缺少早期診斷的標(biāo)記物，大多數(shù)肝癌患者都是在晚期才被診斷出來，因而不能得到較好的治療（死亡率比發(fā)生率為0.95）。所以，急需一種肝癌的新診斷標(biāo)記物和新治療策略以用于改善肝癌患者的預(yù)后水平。

人類腸道微生物一直以來都是一個(gè)和人體共生的最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。最近有關(guān)于動(dòng)物模型的研究表明腸道微生物通過腸道-微生物-肝這一軸線促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。然而，直到現(xiàn)在，肝癌患者的腸道微生物特性還沒被報(bào)道。

腸道微生物作為包括2型糖尿病，結(jié)直腸癌等特殊疾病或癌癥的無創(chuàng)性診斷工具一直是個(gè)引入注目的研究領(lǐng)域，作者之前就基于98個(gè)肝硬化患者和83個(gè)健康對照的腸道微生物的15個(gè)基因生物標(biāo)記物設(shè)立了精準(zhǔn)患者鑒別指數(shù)，借助腸道微生物標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)了對胰腺癌的有力分類。這提示了腸道微生物有作為無創(chuàng)診斷工具的可能。但是，腸道微生物對于肝癌的診斷潛力還不能得到準(zhǔn)確評價(jià)，基于此，本文開展了研究。

文章收集了中國東部地區(qū)，中部地區(qū)和西北部地區(qū)的總共486例糞便樣品，但是經(jīng)過嚴(yán)格的病理診斷和排除篩選，最后剩下150個(gè)肝癌患者，40個(gè)肝硬化患者，131個(gè)健康對照進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，他們被隨機(jī)分到發(fā)現(xiàn)階段組和驗(yàn)證階段組（圖1）。在發(fā)現(xiàn)階段，作者對75個(gè)健康對照，40個(gè)肝硬化患者，75個(gè)肝硬化特征的肝癌早期患者進(jìn)行了測試，鑒定了微生物標(biāo)記物，利用關(guān)于肝癌早期患者人群和非肝癌人群的隨機(jī)森林模型，構(gòu)建了一個(gè)肝癌分類器。在驗(yàn)證階段，使用56個(gè)健康對照人群，30個(gè)肝癌早期患者，45個(gè)肝癌晚期患者對肝癌分類器進(jìn)行了有效性的驗(yàn)證。并且，作者還對新疆地區(qū)的18個(gè)肝癌患者，鄭州地區(qū)的80個(gè)肝癌患者進(jìn)行了關(guān)于肝癌分類器潛力的獨(dú)立驗(yàn)證。

肝癌早期患者表現(xiàn)腸道微生物多樣性增加

對于發(fā)現(xiàn)階段人群的稀釋曲線分析顯示每一個(gè)人群中有著接近飽和的操作分類單元（OTUs，細(xì)菌基因相似度大于95%稱為一個(gè)OUT，是微生物組學(xué)中一種人為設(shè)置的分類標(biāo)志）豐度，肝硬化患者相比健康人群OTUs豐度明顯降低，肝癌早期患者相比肝硬化患者OTUs豐度增加了（圖2A）。相對健康人群而言，肝硬化患者的糞便微生物多樣性（體現(xiàn)在香農(nóng)指數(shù)，辛普森指數(shù)，因維辛普森指數(shù)）明顯降低（分別是p=0.0011, 0.0007 和 0.0007）。相反，相比較肝硬化患者，肝癌早期患者的微生物多樣性明顯增加（分別是p=0.0234, 0.0068和0.0068）（圖2B-D）。

同時(shí)，韋恩圖展示了不同人群之間的重疊部分，932個(gè)OTUs中有524個(gè)是三個(gè)人群共有的，863個(gè)OTUs中有564個(gè)是肝硬化和肝癌早期患者共有的（圖2E），932個(gè)OTUs中有90個(gè)是肝癌早期獨(dú)有的。然后，作者使用加權(quán)UniFrac方法計(jì)算β多樣性，PCoA分析(主坐標(biāo)分析，用來表示樣本間的微生物距離)表明了所有人群樣本中糞便腸道微生物群體的均勻分布。（圖2F）

肝癌早期患者的糞便微生物群體的系統(tǒng)發(fā)育譜

種系型別相對豐度的中值比總體豐度高了0.01%。為了鑒定肝癌早期患者的關(guān)鍵OTUs種系型別，作者對OTUs豐度使用了基于Benjamini-Hochberg方法的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)?？偣泊_定了110個(gè)OTUs作為肝癌早期患者的關(guān)鍵系譜，它們的豐度和分布在補(bǔ)充材料圖S3可見。

擬桿菌門，厚壁菌門和變形菌門占據(jù)了整體測序結(jié)果菌群中的90%，它們是這三類人群中的3類統(tǒng)治性微生物（圖3A）。相比肝硬化患者，肝癌早期患者中放線菌門明顯增加了（p=0.0049，圖3C，補(bǔ)充材料表S6）。相應(yīng)的，Paraprevotella，Parabacteroides,吉米菌屬等13個(gè)菌屬在肝癌早期患者中比肝硬化患者更豐富（所有的p<><>

鑒定肝癌早期的OTUs-微生物標(biāo)記物 

為了便于解釋糞便微生物對于肝癌早期的診斷價(jià)值，作者構(gòu)建了一個(gè)可以特異地從非肝癌樣品中鑒定出肝癌早期樣品的隨機(jī)森林分類器模型。為了檢測肝癌早期患者獨(dú)特的OTUs標(biāo)記物，在實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)階段，作者對75個(gè)肝癌早期患者和105個(gè)非肝癌樣本（40個(gè)肝硬化患者和75個(gè)對照）使用隨機(jī)森林模型進(jìn)行了五倍交叉驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30個(gè)OTU標(biāo)記物適合作為最優(yōu)標(biāo)記物集（圖4A）。這30個(gè)OTUs標(biāo)記物對應(yīng)的細(xì)菌屬名參見補(bǔ)充材料表格S10。

在發(fā)現(xiàn)階段組，患病概率（POD）指數(shù)的AUC（越高代表分類器越準(zhǔn)確）值為80.645(CI為95%，肝癌早期人群到非肝癌人群，AUC值從74.47%變化到86.8%)（圖4B）。肝癌早期樣本相比非肝癌樣本，POD值顯著增加（p=1.5x10-14 ，圖4C）。這些資料表明建立在微生物OTUs標(biāo)記物基礎(chǔ)上的POD值在區(qū)分非肝癌患者肝癌早期患者中有足夠強(qiáng)的診斷潛力。

驗(yàn)證肝癌獨(dú)立診斷的微生物標(biāo)記物

在驗(yàn)證階段實(shí)驗(yàn)中，30個(gè)肝癌早期患者相比于56個(gè)對照樣本（p=2.2×10–7，圖5A），平均POD值有了明顯增加，POD指數(shù)的AUC值為76.80%(95% CI 67.90% to 85.70%，肝癌早期到對照人群)（（圖5B），這也驗(yàn)證了POD對于肝癌早期的重要診斷潛力。為了闡明建立POD對于肝癌的特異性，作者進(jìn)一步招募肝癌晚期患者來驗(yàn)證診斷潛力。結(jié)果表明45個(gè)肝癌晚期人群相比56個(gè)對照樣本，POD值明顯更高（p=2.3×10–6，圖5A），POD指數(shù)的AUC值為80.40% (95% CI 70.70% to 90.20%，肝癌晚期到對照人群)。這也進(jìn)一步說明了POD值診斷肝癌晚期的明顯高效性。同時(shí)，為了確認(rèn)POD值的診斷潛力和受檢者范圍，新疆地區(qū)的18個(gè)肝癌患者，鄭州地區(qū)的80個(gè)肝癌患者分別進(jìn)行獨(dú)立診斷來確認(rèn)POD的可信性。這2個(gè)地區(qū)肝癌患者相對對照人群的平均POD值都有明顯增加，新疆人群的POD指數(shù)的AUC值為79.2%（95%CI67.40%to 90.90%)）,鄭州人群的POD指數(shù)的AUC值81.7%（95%CI74.60%to 88.80%)(圖5D,5E)。這3個(gè)結(jié)果表明了關(guān)于微生物標(biāo)記物的POD值診斷中國西北部到中部地區(qū)肝癌患者的有效性。

本文證明了大人群肝癌早期患者腸道微生物的特征性改變，明確了導(dǎo)致肝癌發(fā)展的候選關(guān)鍵微生物，鑒定了特異性的微生物標(biāo)記物并且驗(yàn)證了其在中國三個(gè)不同地區(qū)的3類人群的診斷效率。所以，作者建議把腸道微生物-靶向生物標(biāo)記物作為肝癌早期患者的無創(chuàng)診斷工具。系統(tǒng)調(diào)查其中的關(guān)鍵菌屬或者種類可能會(huì)進(jìn)一步提高腸道微生物-靶向生物標(biāo)記物對于肝癌的診斷價(jià)值，而微生物標(biāo)記物和現(xiàn)在常見的診斷方法相結(jié)合對于肝癌患者的診斷是非常有幫助的。當(dāng)然，對不同國家或者不同民族的更多人群進(jìn)行腸道微生物-靶向生物標(biāo)記物的驗(yàn)證研究會(huì)更有助于提高肝癌診斷的效率和穩(wěn)定性，而這也是未來更早實(shí)現(xiàn)微生物標(biāo)記物用于肝癌早期診斷和早期治療所需要的。

關(guān)于肝癌的腸道微生物-靶向生物標(biāo)記物的鑒定是人類探索自身第二套基因組和第一套基因組相互作用關(guān)系進(jìn)程中的一小步勝利，但凡涉及到大人群大隊(duì)列的研究，多會(huì)強(qiáng)調(diào)參與人群的地區(qū)特異性，民族特異性和數(shù)量廣泛性等，對于腸道微生物之與腫瘤關(guān)系，小編認(rèn)為也許可以先擴(kuò)大足夠的參與研究人群數(shù)目，發(fā)現(xiàn)一些全體人群共同的OUTs之后，再分地理區(qū)域，種族，飲食生活習(xí)慣，氣候條件等做一些子一級的細(xì)化分析，也許會(huì)有意想不到的收獲。同時(shí)，針對獲得的共同性微生物乃至不同人群的特異性微生物，可以從生理生化等角度分析下，看是否在產(chǎn)物，干涉人體代謝通路等水平存在一致性或相似性。這樣，以后可以更明白的剖析，鑒定微生物-癌癥的二元關(guān)系。