大反派“元素眾”預(yù)告現(xiàn)身，由未知宇宙四名操控元素的頂尖高手組成，分別是操控火焰的地獄火、操控水流的海昌、操控大地的瑪格南和風(fēng)之主宰西風(fēng)。最最驚喜的是身穿中世紀鎧甲，手中放射綠色光的神秘客震撼亮相，和小蜘蛛一起并肩作戰(zhàn)打敗元素怪物！

此次蜘蛛俠將前往歐洲展開新的征程，并將對抗由杰克·吉倫哈爾加盟飾演的大反派神秘客，贊達亞、雅各布·巴特朗、托尼·雷沃羅利等原班人馬也將悉數(shù)回歸。

小蜘蛛即將踏上屬于他的新征程，小編也將帶領(lǐng)大家開啟本次全新熒光定量小課堂！DougRains教授將為大家解答關(guān)于設(shè)置閾值線的相關(guān)問題。

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今天小問題是：什么是閾值線，我應(yīng)該把閾值線設(shè)置在哪里？這個問題問得非常好。閾值線是與擴增曲線相交的一條水平線，可以沿著Y軸方向上下移動。

那它的作用是什么？我們稍后會看到，軟件是在哪兒設(shè)定閾值線的。

當(dāng)然，不是Y軸上所有的地方都可以的，有些區(qū)域不是很合適。比如，閾值線不能太低，否則就會受到噪音信號的干擾。反之，如果閾值線設(shè)置的太高，到達擴增線性期或平臺期，那這時的數(shù)據(jù)就是不準(zhǔn)確的。

那閾值線設(shè)置在哪兒最好呢？其實閾值線應(yīng)該設(shè)置在擴增曲線接近線性和線與線之間相互平行的位置。對于實驗來說最好是將閾值線設(shè)置在樣本重復(fù)性最好的區(qū)域。這通常是在指數(shù)擴增期的中期或后期。

不過無論在什么時候，當(dāng)有了性能卓越的反應(yīng)預(yù)混液，得到一個好的實驗結(jié)果就會非常容易。對于所有Applied Biosystems?熒光定量PCR軟件，默認都是自動設(shè)置閾值線。

就是說，當(dāng)我們點擊Analyze（分析）按鈕時，軟件會自動為我們的實驗設(shè)置好最佳閾值線。請注意，我們的軟件會分別為每種Assay單獨設(shè)置閾值線。這是非常必要的，因為不同的assay的最佳閾值線是不同的。

當(dāng)然只要我愿意，可以把閾值線設(shè)置調(diào)整為手動模式，然后用鼠標(biāo)進行上下調(diào)整。當(dāng)閾值線設(shè)定好后，我們點擊分析按鈕，就能得到所有樣本的Ct值了。

細心的同學(xué)可能會問：如果閾值線可以向上或向下移動，那Ct值會不會隨之變動么？答案是“會的”。但是實際上，只要將閾值線設(shè)定在合適的范圍內(nèi)，任何兩個樣品間的相對Ct值或△Ct值都會保持不變。這也讓我們可以依據(jù)相對Ct值或△Ct值來計算不同樣本間基因表達量的倍數(shù)變化，也可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行絕對定量分析。

以上就是今天的內(nèi)容。如果您有任何關(guān)于熒光定量PCR的問題，請Ask TaqMan吧。

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