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ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測(cè)的方法，主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡(jiǎn)單，整個(gè)測(cè)定過(guò)程中卻有諸多影響因素，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題，我們將常見(jiàn)問(wèn)題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表： 問(wèn)題一：高背景或陰性對(duì)照值偏高 可能原因 | 建議 | 陰性對(duì)照孔被陽(yáng)性對(duì)照或樣品污染 | 洗滌時(shí)，勿將洗液溢出孔外 | 抗體非特異性結(jié)合 | 封閉液不適合，更換封閉液 | 酶結(jié)合物過(guò)濃 | 請(qǐng)檢查酶結(jié)合物是否按說(shuō)明書(shū)規(guī)定稀釋 | 孵育溫度過(guò)高 | 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定 | 底物在使用前曝光 | 應(yīng)保存在暗處，避光 | 讀板前停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù) |
問(wèn)題二：陽(yáng)性對(duì)照值偏低或低吸光度
可能原因 | 建議 | 試劑未平衡至室溫 | 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒從冰箱取出平衡至室溫 | 檢測(cè)體積偏小 | 檢查移液器吸液管道是否堵塞 | 孵育時(shí)間過(guò)短 | 使用計(jì)時(shí)器，準(zhǔn)確孵育時(shí)間 | 底物受污染 | 使用新配置的試劑，重新實(shí)驗(yàn) | 包裝袋中有濕氣 | 檢查袋中是否有干燥劑 | 樣本中有抑制劑 | 疊氮鈉會(huì)抑制HRP酶的活性 |
問(wèn)題三：邊緣效應(yīng)
可能原因 | 建議 | 蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板 | 溫度不均勻 | 校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板 |
問(wèn)題四：標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
可能原因 | 建議 | 倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未混勻 | 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻 | 過(guò)早稀釋 | 標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時(shí)稀釋 | 加入的體積不正確 | 使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器，快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個(gè)微孔中 |
問(wèn)題五：標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣本無(wú)檢測(cè)信號(hào)
可能原因 | 建議 | 樣本中無(wú)檢測(cè)物或檢測(cè)物含量極低 | 設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn) | 樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測(cè) | 作適當(dāng)稀釋?zhuān)档推渌镔|(zhì)的干擾，或作系列稀釋?zhuān)瑱z測(cè)回收率 | 樣本中檢測(cè)物濃度過(guò)高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值 | 適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測(cè)物濃度盡量在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi) |
問(wèn)題六：重復(fù)性較差
可能原因 | 建議 | 微孔中有氣泡 | 用針尖挑破氣泡 | 試劑未混勻 | 確保充分混勻試劑 | 樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 | 使用前離心 | 微孔包被面被吸頭劃破 | 加液時(shí)小心操作 | 使用用過(guò)的封板膠紙 | 每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔 |
問(wèn)題七：假陽(yáng)性反應(yīng) 可能原因 | 建議 | 洗滌不充分 | 使用前需檢查洗板機(jī)是否正常工作 | 洗板機(jī)管道堵塞 | 需經(jīng)常維護(hù)洗板機(jī) | 加結(jié)合物時(shí)，灑在微孔邊緣 | 小心向微孔加入結(jié)合物，加入微孔底部中央，避免與孔壁和邊緣接觸 | 檢測(cè)樣本中含有紅細(xì)胞 | 離心 | 微孔中液體揮發(fā) | 用封板膠密封反應(yīng)孔，置于濕盒內(nèi) |
問(wèn)題八：整塊板產(chǎn)生陽(yáng)性O(shè)D值或整個(gè)板顯藍(lán)色
可能原因 | 建議 | 洗滌液體積不足或底物被殘留于孔底的結(jié)合物所污染 | 洗滌時(shí)，緩沖液充滿(mǎn)至孔邊緣，但要確保不能溢出孔外 | 結(jié)合物濃度過(guò)高 | 檢查是否按照說(shuō)明書(shū)推薦比例稀釋 | 血清中有血清因子 | 勿加熱血清 | 底物容器不潔凈 | 用酸清洗容器瓶，用蒸餾水沖洗 | 底物孵育時(shí)，微孔板曝光 | 加底物時(shí)，立即將板置于暗處 |
問(wèn)題九：整塊板OD值偏低
可能原因 | 建議 | 顯色時(shí)間不足 | 適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間 | 孵育溫度偏低 | 36度為最適反應(yīng)溫度（欣博盛ELISA試劑盒） | 未加終止液 | 加入終止液，增強(qiáng)顏色反應(yīng)的強(qiáng)度，穩(wěn)定最終的顏色反應(yīng) |
問(wèn)題十：顯色緩慢
可能原因 | 建議 | 樣本未置于室溫 | 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將樣本平衡至室溫 | 酶結(jié)合物活性減弱 | 檢測(cè)稀釋度 | 酶活性收到抑制如疊氮鈉 | 避免實(shí)驗(yàn)不當(dāng)?shù)姆栏瘎?/span> | 顯色溫度不適當(dāng) | 按說(shuō)明書(shū)操作 |
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