轉(zhuǎn)錄組測序概述及實驗分析流程（分享）

昵稱55axV6J3 2019-02-11

展開全文

一、轉(zhuǎn)錄組測序概述
轉(zhuǎn)錄組是特定物種、組織或細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄的所有RNA（轉(zhuǎn)錄本）的集合，包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding RNA，非編碼RNA又包括：tRNA，rRNA，snoRNA，microRNA，piRNA，lncRNA等。通過比較轉(zhuǎn)錄組或基因表達譜的研究以揭示生物學(xué)現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機制是高通量組學(xué)研究的一個常用策略。利用高通量測序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組在全面快速得到基因表達譜變化的同時，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異，另外對于檢測低豐度轉(zhuǎn)錄本和發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本具有其獨特的優(yōu)勢。
二、研究轉(zhuǎn)錄組方法有哪些
目前研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要三種：
1. 基于雜交技術(shù)的cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片
2. 基于sanger測序法的SAGE (serial analysis of gene expression)、LongSAGE和MPSS(massively parallelsignature sequencing)
3. 基于第二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序，又稱為RNA-Seq。

三、轉(zhuǎn)錄組測序有什么樣的樣品要求？
（1）樣品純度要求： OD值應(yīng)在1.8至2.2之間；電泳檢測28S:18S至少大于1.8。
（2）樣品濃度： totalRNA濃度不低于400ng/μg。
（3）total RNA樣品請置于-20℃保存；請?zhí)峁﹖otalRNA樣品具體濃度、體積、制備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數(shù)據(jù)，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數(shù)據(jù)。
（4）樣品請置于1.5 ml管中，管上注明樣品名稱、濃度以及制備時間，管口使用Parafilm封口。建議使用干冰運輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過程中樣品降解的可能性。
四、轉(zhuǎn)錄組測序需要多大的測序量才能得到有意義的結(jié)果？
轉(zhuǎn)錄組測序前，需要對物種轉(zhuǎn)錄組的大小進行評估，評估方法如下：
（1）對于有reference genome的物種，可以分析基因組信息，統(tǒng)計編碼基因的個數(shù)，及其堿基數(shù)，從而估計物種轉(zhuǎn)錄組的大小，另外可以查詢相關(guān)或相近物種轉(zhuǎn)錄組研究的文獻，作為參考。
（2）對于無reference genome的物種則只能參考相近物種的轉(zhuǎn)錄組大小。
由于轉(zhuǎn)錄組需要進行表達量的分析，因此在轉(zhuǎn)錄組測序中不推薦覆蓋度，在進行不同基因和不同實驗間的基因表達差異分析時，人們提出了RPKM和FPKM的概念。RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）是每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)。FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM與RPKM計算方法基本一致。不同點就是FPKM計算的是fragments，而RPKM計算的是reads。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-end的一個fragment，也可以是一個read。因此，在確定轉(zhuǎn)錄組的測序量時，最好以產(chǎn)生的讀長數(shù)目做依據(jù)，參照轉(zhuǎn)錄組大小，估計需要的讀長數(shù)目，來確定轉(zhuǎn)錄組需要的測序量。
五、轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灱夹g(shù)路線