RNA-seq是一種基因表達量測定方法。簡單來說，樣品中的RNA反轉錄后進行量測序，將得到的reds比對到參考序列上，來計算基因的表達量。但是，
樣品間在數據總量、基因長度、基因數目、高表達基因分布甚至同一個基因的不同轉錄本分布上都有差別。因此不能直接比較表達量，而是必須將數據進行歸一化處理。 假陽性率： 重要的評價指標，表達相近的基因被誤認為是差異表達的基因 假陰性率： 重要指標，差異表達的基因沒有被找出的比例。 所以，RNA-seq找差異表達分析時理應遵循以下幾項原則： 樣品間沒有整體表達量上的差異 正向差異表達與負向差異表達整體趨勢相近（正負差異平衡） 在二個樣品中表達量相同（無關處理）的基因不應被標記為差異基因（不應出現假陽性） 看家基因可作為表達量評價依據（待定）
ok，現在終于進入正題，高出鏡率的RPKM，公式如下：
作為最廣泛使用的歸一化算法，RPKM卻有很多弊端： 基因表達平衡問題 現象：個別表達量很高的基因，會引起其他低表達量的差異假陽性。 原因：假設2個樣品A、B，二者差異表達的只有一個基因，差異量為rDE.由于數據量R相同，B的平均測序深度必將降低。 則對于某個相同表達的基因g： 則A的RPKMg=(rg*109)/(flg*R); 且B的RPKMg =((rg*R/(R+ rDE )*109)/(flg*R); 二者顯然不同（一般認為rDE<<R情況下可以無視) 基因數的影響 現象：二個樣品檢測到的基因數不同，會影響RNA-seq結果。 原因：如樣品A表達12000個基因，樣品B則表達10000個基因。則只在A中表達的基因2000個必定是差異表達基因（相對B中表達量為0）。但樣品總reads不一定A>B，因為其他基因的表達量差異未知。 如果其他基因的表達量相差不大，則結果如1中情況。 轉錄本的問題 現象：兩個相同表達的基因呈現差異假陽性 原因：可變剪接的存在讓一個基因存在多個不同的轉錄本，兩個樣品中總體相對較短（含有較多的短轉錄本）的轉錄本的表達量較少。 解決方法： （一）只統(tǒng)計基因開頭的序列READS （二）找出reads對基因的覆蓋度，并將影響算出
所以，即然RPKM有這么多弊端，有沒有其他參數來替代，當然有! RPKM的優(yōu)化版本——TPM 公式是下面這樣的， 設Qg = (rg*rl)/flg；則TPM = Qg/∑Qg （ ∑Qg等于上式中的T） rg：基因g的reads數 ；rl：(總長度∑flg)L/(總reads數)R； flg：基因的長度。 可知Qg的意義是： （大部分人看到上面這幾個公式都凌亂了，but，你只要記住下面這句話就可以了，學霸除外……） 由此可知，TPM概括了基因的長度、表達量和基因數目。 
對單一人體細胞樣本的TPM與RPKM結果數值間的比較
對人不同類型的細胞和雞細胞樣品間 TPM與RPKM結果數值比較 可以看出，對單一的樣本，TPM與RPKM的結果基本上是一致的。而對于同一物種不同樣本，TPM與RPKM比例f有變化（最多14%），而不同物種間無可比性。 
上圖描述的是用TPM與RPKM分析兩種人體細胞樣品的表達量差異，所得結果進行t檢驗后得到的p值的分布?？梢钥吹剑琑PKM相對TPM，明顯較高P值的差異結果較多。說明RPKM可能引入了人為的表達量差異。
|
