糖尿病是一類(lèi)以高血糖癥為特征的代謝紊亂疾病。經(jīng)常和長(zhǎng)期存在的高血糖癥可導(dǎo)致許多微血管并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR），糖尿病腎病，糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病足病。高血糖癥損傷的早期和主要靶點(diǎn)是視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)。最初糖尿病視網(wǎng)膜病變的特點(diǎn)表現(xiàn)為以下幾種形態(tài)學(xué)變化，包括周細(xì)胞減少，基底膜增厚，血管通透性增加，血管閉塞和血管閉塞微動(dòng)脈瘤。視網(wǎng)膜血管細(xì)胞主要包括周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）。糖尿病患者和動(dòng)物發(fā)生糖尿病性視網(wǎng)膜病變，其早期的病理特征是周細(xì)胞丟失。視網(wǎng)膜ECs的表型經(jīng)歷從正常的靜止表型轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲龊突钴S的表型。視網(wǎng)膜EC功能障礙可導(dǎo)致血管滲透性，黃斑水腫和血管生成增加。正常的周細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞“對(duì)話(huà)”對(duì)視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持來(lái)說(shuō)是非常重要的。異常的周細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞“對(duì)話(huà)”則可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管滲漏，閉塞和新血管的形成。因此，基于調(diào)節(jié)周細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞“對(duì)話(huà)”的治療干預(yù)手段將預(yù)防和保護(hù)糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管損傷。

來(lái)自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院附屬耳鼻喉眼科醫(yī)院的顏標(biāo)研究團(tuán)隊(duì)最近于PNAS期刊（IF=9.504）上在線(xiàn)發(fā)表了題為“Targeting pericyte-endothelial cell crosstalk by circular RNA-cPWWP2A inhibition aggravates diabetes-induced microvascular dysfunction”的研究，該研究顯示糖尿病應(yīng)激上調(diào)視網(wǎng)膜周細(xì)胞，而不是內(nèi)皮細(xì)胞中cPWWP2A的表達(dá)水平。體外研究表明，cPWWP2A充當(dāng)內(nèi)源性miR-579的海綿，調(diào)控Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表達(dá)，直接調(diào)節(jié)周細(xì)胞生物學(xué)功能，而通過(guò)攜帶cPWWP2A的外泌體間接調(diào)節(jié)ECs生物學(xué)功能，促進(jìn)ECs的遷移和血管形成能力。體內(nèi)研究表明，cPWWP2A過(guò)表達(dá)或抑制miR-579表達(dá)可減輕糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管功能障礙。 相反，抑制cPWWP2A表達(dá)或過(guò)表達(dá)miR-579會(huì)加重視網(wǎng)膜血管功能障礙。這項(xiàng)研究揭示了周細(xì)胞和ECs “對(duì)話(huà)”的新機(jī)制，干預(yù)cPWWP2A或miR-579的表達(dá)可為治療糖尿病微血管并發(fā)癥提供治療策略。

1. circRNA表達(dá)譜分析鑒定cPWWP2A可作為糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在調(diào)控分子

作者主要分析db/db糖尿病小鼠模型和非糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中的circRNA表達(dá)譜，其中433種上調(diào)，411種下調(diào)，再通過(guò)對(duì)比circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇與circBase庫(kù)記錄吻合的circRNAs,從中隨機(jī)篩選并qRTPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)20種上調(diào)和下調(diào)水平最明顯的circRNAs。在上調(diào)最明顯的三種mmu_circ_0010536, mmu_circ_0004367和 mmu_circ_0000254，其中小鼠mmu_circ_0000254（cPWWP2A）與人同源的hsa_circ_0074837的相似性高達(dá)89%。Sanger測(cè)序和RNase R消化實(shí)驗(yàn)鑒定cPWWP2A屬于來(lái)源于PWWP2A基因的環(huán)狀RNA。鏈脲霉素誘發(fā)小鼠糖尿病后或者在db/db小鼠，其視網(wǎng)膜中cPWWP2A表達(dá)水平明顯上調(diào)，而胰島素治療可以明顯抑制cPWWP2A表達(dá)。而且糖尿病患者的纖維血管膜中的cPWWP2A表達(dá)水平也明顯上調(diào)。

2.  cPWWP2A與體內(nèi)糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管功能障礙有關(guān)

免疫熒光染色（綠色代表血管，紅色代表周細(xì)胞）證明敲低cPWWP2A表達(dá)可以明顯降低視網(wǎng)膜血管中周細(xì)胞的覆蓋水平；Evans blue實(shí)驗(yàn)證明與糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜相比，敲低cPWWP2A表達(dá)會(huì)明顯加重糖尿病引起視網(wǎng)膜的血管滲漏；糖尿病視網(wǎng)膜的重要特征包括周細(xì)胞丟失、小動(dòng)脈瘤和非細(xì)胞組成的微血管。胰蛋白酶消化視網(wǎng)膜血管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低cPWWP2A表達(dá)進(jìn)一步增加了糖尿病視網(wǎng)膜的中非細(xì)胞組成的血管、周細(xì)胞丟失和微動(dòng)脈瘤的數(shù)量；ELISAs實(shí)驗(yàn)證明敲低cPWWP2A表達(dá)還會(huì)促進(jìn)炎癥因子IL-2, IL6, TNF-α, VEGF和MCP-1的分泌，加重糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)。但是如果過(guò)表達(dá)cPWWP2A則出現(xiàn)相反的結(jié)果，起到保護(hù)周細(xì)胞免受糖尿病誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷的作用。

3. cPWWP2A在體外調(diào)控視網(wǎng)膜周細(xì)胞功能及其與內(nèi)皮細(xì)胞的“對(duì)話(huà)”

視網(wǎng)膜血管細(xì)胞主要包括周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞兩種，與糖尿病相關(guān)的應(yīng)激（如高糖、氧化應(yīng)激和炎癥刺激），顯著上調(diào)了周細(xì)胞中cPWWP2A的表達(dá)，但未改變內(nèi)皮細(xì)胞中cPWWP2A的表達(dá)水平。由于高血糖對(duì)視網(wǎng)膜血管損傷的影響，周細(xì)胞丟失是早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的一個(gè)標(biāo)志。體外實(shí)驗(yàn)中，周細(xì)胞暴露于高糖環(huán)境中，可以模擬體內(nèi)糖尿病環(huán)境。PI染色和caspase 3/7活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，敲低cPWWP2A表達(dá)促進(jìn)了高糖應(yīng)激誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡。

增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變通常包括有害性的視網(wǎng)膜血管生成。正常的周細(xì)胞功能和周細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞間的 “對(duì)話(huà)”對(duì)視網(wǎng)膜血管的穩(wěn)定性和新生血管系統(tǒng)的成熟具有重要意義。敲低cPWWP2A表達(dá)可抑制周皮細(xì)胞標(biāo)記物（(PDGF)-β, α-SMA, Desmin,和 NG2）的表達(dá)，抑制周細(xì)胞的增殖。在周細(xì)胞和人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRVECs)共培養(yǎng)模型中，敲低cPWWP2A表達(dá)抑制了HRVECs募集周細(xì)胞的現(xiàn)象。同時(shí)在周細(xì)胞中敲低cPWWP2A表達(dá)也顯著增加了內(nèi)皮對(duì)大分子的通透性。

4. cPWWP2A調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能的具體機(jī)制是什么？

因?yàn)閏PWWP2A主要分布在周細(xì)胞的胞漿，所以作者猜測(cè)cPWWP2A可能作為miRNA的海綿，調(diào)控基因表達(dá)。Ago2蛋白是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的核心成分，它將miRNA復(fù)合物與靶mRNAs結(jié)合。RIP實(shí)驗(yàn)證明Ago2抗體可以特異性捕獲到內(nèi)源性cPWWP2A；結(jié)合TargetScan預(yù)測(cè)的靶miRNAs，通過(guò)luciferase reporter實(shí)驗(yàn)篩選到只有miR-579可明顯抑制其熒光素酶活性；同時(shí)miR-579與cPWWP2A存在共定位的現(xiàn)象，兩者也存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。所以cPWWP2A很有可能作為miR-579的海綿，調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能。

5. cPWWP2A作為miR-579的海綿，下游靶向什么基因，調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能？

生信分析預(yù)測(cè)了angiopoietin1/occludin/SIRT1三個(gè)基因可能是miR-579的下游靶基因。Luciferase reporter實(shí)驗(yàn)證明miR-579與這三種靶基因的潛在相互作用。體外敲低cPWWP2A表達(dá)可以明顯抑制angiopoietin1/occludin/SIRT1三個(gè)基因的表達(dá)水平；過(guò)表達(dá)miR-579進(jìn)一步加重高糖應(yīng)激誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡，抑制周細(xì)胞標(biāo)志物（PDGF-β, α-SMA, Desmin, 和 NG2）的表達(dá)，抑制周細(xì)胞的增殖，抑制HRVECs對(duì)周細(xì)胞的招募。而過(guò)表達(dá)cPWWP2A則會(huì)部分逆轉(zhuǎn)miR-579過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的這些效應(yīng)。

6. 在體內(nèi)cPWWP2A–miR-579–Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1軸對(duì)于視網(wǎng)膜血管功能障礙的影響？

應(yīng)用miR-579激動(dòng)劑或者敲低cPWWP2A表達(dá)都可明顯抑制小鼠視網(wǎng)膜中Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表達(dá)。應(yīng)用miR-579激動(dòng)劑明顯降低視網(wǎng)膜血管中周細(xì)胞的覆蓋水平，增加糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的中非細(xì)胞組成的血管、周細(xì)胞丟失和微動(dòng)脈瘤的數(shù)量，明顯加重糖尿病引起視網(wǎng)膜的血管滲漏。而應(yīng)用miR-579拮抗劑則獲得與之相反的結(jié)果。之前的結(jié)果已經(jīng)證明敲低cPWWP2A表達(dá)可造成視網(wǎng)膜血管功能障礙，而當(dāng)同時(shí)注射外源性miR-579拮抗劑則會(huì)抵消這血管功能障礙的負(fù)面效應(yīng)。

7. 周細(xì)胞中的cPWWP2A通過(guò)什么機(jī)制影響ECs的功能和調(diào)節(jié)兩者間的“對(duì)話(huà)”？

相比與非糖尿病視網(wǎng)膜，來(lái)源于糖尿病視網(wǎng)膜的周細(xì)胞和ECs中的cPWWP2A表達(dá)水平明顯上調(diào)。在體外，高糖應(yīng)激只會(huì)誘導(dǎo)周細(xì)胞，而不是ECs的cPWWP2A表達(dá)上調(diào)，提示cPWWP2A可能通過(guò)旁分泌途徑進(jìn)入ECs。原位雜交和熒光染色實(shí)驗(yàn)證明在非糖尿病視網(wǎng)膜的周細(xì)胞和ECs中都表達(dá)cPWWP2A，而在糖尿病視網(wǎng)膜中，周細(xì)胞數(shù)量減少，cPWWP2A主要在ECs中表達(dá)。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)高糖應(yīng)激可以促進(jìn)周細(xì)胞分泌cPWWP2A到培養(yǎng)基上清中，用這種上清培養(yǎng)ECs可促進(jìn)ECs的遷移和血管形成能力。而且相比非糖尿病小鼠，糖尿病小鼠的血漿中cPWWP2A的表達(dá)水平明顯上調(diào)。應(yīng)用蛋白酶K, 而不是DNase I或者RNase A，降低周細(xì)胞培養(yǎng)基中cPWWP2A的表達(dá)水平。

胞外囊泡可能來(lái)源于凋亡小體或者細(xì)胞不斷分泌的外泌體。應(yīng)用外泌體分泌抑制劑—GW4869，而不是凋亡抑制劑ZVAD有效抑制從周細(xì)胞轉(zhuǎn)移到ECs的 cPWWP2A的水平，提示可能是外泌體介導(dǎo)cPWWP2A的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。為了排除ECs自身cPWWP2A表達(dá)的影響，高糖處理周細(xì)胞后的上清可以顯著提高cPWWP2A?/? ECs的增殖、遷移和血管形成能力。但當(dāng)同時(shí)加入cPWWP2A反義轉(zhuǎn)錄本，可以抵消促進(jìn)ECs遷移和血管形成能力的效應(yīng)，進(jìn)一步提示周細(xì)胞分泌到上清中cPWWP2A的重要性。