多細胞生物僅僅由單個細胞發(fā)育而來的全過程非常令人驚訝。在線蟲中可以使用經(jīng)典的譜系追蹤實驗來研究單細胞到多細胞的發(fā)生發(fā)育過程，并從中發(fā)現(xiàn)細胞譜系之間的差異以及功能表型方面的不同，但是這些研究結(jié)果也是取決于線蟲本身的發(fā)育過程已經(jīng)研究地非常透徹。更復(fù)雜的生物體的是如何精妙地調(diào)控的身體發(fā)育過程的還很不清楚。

為了進一步揭開哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程，加州大學(xué)舊金山分校Jonathan S. Weissman研究組與MIT&Harvard Board研究所的Alexander Meissner研究組在Nature上合作發(fā)文Molecular recording of mammalian embryogenesis，為小鼠原腸胚發(fā)育過程的研究進一步提供了可用的工具。

單細胞RNA測序技術(shù)應(yīng)用的如火如荼，對于揭開細胞種類的異質(zhì)性、研究多種動物中的發(fā)育過程提供了重要的工具平臺【1,2】（關(guān)于哺乳動物胚胎發(fā)育過程，BioArt在3月10日曾報道了兩篇背靠背Nature文章，詳見：背靠背Nature長文丨曹俊越博士等利用單細胞測序揭示胚胎發(fā)育路徑）。最近，以CRISPR-Cas9為基礎(chǔ)的技術(shù)也被用于記錄細胞譜系發(fā)生【3】。但是這些研究編碼多樣性的產(chǎn)生很少，很大程度上限制了在其他組織和生命體中的應(yīng)用。

那么理想的多細胞生物中發(fā)育過程的分子記錄器需要具備什么樣的特點呢？1）首先對于細胞表型方面的影響要降到最低；2）對于數(shù)以萬計的細胞能夠高通量記錄信息；3）能夠同時分析單細胞的功能信息；4）可用于記錄大尺度時間線上的變化；5）在整個實驗過程中連續(xù)產(chǎn)生多樣性用于研究。因此，能夠滿足以上要點的技術(shù)需求隨著人們想要進一步揭開生命發(fā)育過程中奧秘而與日俱增。

Weissman與Meissner研究組的工作希望建立一種方法能夠同時記錄細胞譜系的歷史以及細胞的狀態(tài)。為了達到該目的，他們使用Cas9產(chǎn)生雙鏈斷裂修復(fù)后造成可遺傳的插入或者缺失突變。他們記錄的是包含3個切割位點以及8堿基對的“整合條碼”（Integration Barcode）205個堿基對的合成DNA。該合成DNA序列被嵌入組成型轉(zhuǎn)錄的熒光蛋白的3‘非翻譯區(qū)，從而能夠通過熒光從轉(zhuǎn)錄組中分析該實驗結(jié)果。另外一個cassette編碼了三個guide RNA，用來記錄多種直接信號（圖1）。此系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量的可遺傳修復(fù)結(jié)果和目標位點，并且可以通過整合條碼對這些序列進行區(qū)分。這些guide RNA是他們通過篩選得到的，可以使用GFP報告基因在超過20天的時間對guide RNA靶標的活性進行監(jiān)控，從而篩選具有廣泛動態(tài)變化范圍的系列。

圖1 “分子記錄器”優(yōu)化實驗原理。

然后他們將優(yōu)化后的技術(shù)運用在小鼠胚胎早期發(fā)育過程從而研究其中細胞命運的變化。將多個靶點整合到基因組中之后，他們又將組成型的Cas9-GFP編碼的精子釋放到卵母細胞之中開始啟動切割。為了證明該技術(shù)的譜系追蹤能力，他們對于胎盤、卵黃囊以及E8.5或者是 E9.5的小鼠胚胎中的靶點進行擴增，并且通過插入缺失標記的相似性來研究這三者之間的關(guān)系，從而評估該技術(shù)的實用性。通過該Cas9-GFP為基礎(chǔ)的譜系追蹤技術(shù)，作者們對于7個胚胎中的單細胞數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)，與細胞中的插入缺失突變標記相似。這些缺失突變標記并不會因為轉(zhuǎn)入體內(nèi)而受到影響，因此進一步確認了優(yōu)化后的技術(shù)可以用于體內(nèi)追蹤細胞譜系的變化。

與此同時，作者們使用單細胞RNA測序技術(shù)對野生型小鼠的原腸胚形成過程中的細胞狀態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)引入的剪切并不會影響小鼠的正常發(fā)育過程。隨后作者們利用單細胞測序結(jié)果系統(tǒng)發(fā)育重建策略對細胞譜系進行分類，從而確定他們建立的細胞譜系“追蹤器”是否有效。通過單細胞測序的結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，細胞譜系發(fā)育距離越近，轉(zhuǎn)錄譜的相似度越高，該結(jié)果與細胞在發(fā)育過程中逐漸分化成特化的細胞類型相一致。同時也可以利用單細胞RNA測序的數(shù)據(jù)來建立一個全面的細胞命運圖譜。

該研究中使用大量信息和持續(xù)記錄的技術(shù)來展現(xiàn)了哺乳動物原腸胚形成過程細胞命運譜系示蹤。通過將CRISPR-Cas9技術(shù)與單細胞RNA測序技術(shù)聯(lián)用并進一步優(yōu)化，揭開了哺乳動物發(fā)育過程中的“黑匣子”難題，為進一步回答更高階的細胞組織的時空調(diào)控等問題打破了技術(shù)瓶頸。希望在未來能夠在大尺度發(fā)育過程中的細胞命運決定的分子調(diào)控方面提供可用的工具和可供參考的思路。

原文鏈接：

https:///10.1038/s41586-019-1184-5

制版人：小嫻子

1. Han, X. et al. Mapping the Mouse Cell Atlas byMicrowell-Seq. Cell 173, 1307,doi:10.1016/j.cell.2018.05.012 (2018).

2. Wagner,D. E. et al. Single-cell mapping ofgene expression landscapes and lineage in the zebrafish embryo. Science 360, 981-987, doi:10.1126/science.aar4362 (2018).

3. Spanjaard,B. et al. Simultaneous lineagetracing and cell-type identification using CRISPR-Cas9-induced genetic scars. Nature biotechnology 36, 469-473, doi:10.1038/nbt.4124(2018).