胎盤(pán)發(fā)育是哺乳動(dòng)物關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程，尤其是在胚胎植入子宮之后，胎兒發(fā)育健康與否與胎盤(pán)發(fā)育的好壞密切相關(guān)。那么在胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中最為關(guān)鍵的事件就是滋養(yǎng)層干細(xì)胞的持續(xù)分化。目前關(guān)于小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞的研究，我們的研究相對(duì)比較清楚。比如我們知道在維持干性相關(guān)的FGF和TGF-β等細(xì)胞因子及其下游信號(hào)通路的作用。另外，也存在幾個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子如Cdx2，Eomes，Esrrb，Elf5，Sox2等轉(zhuǎn)錄因子被我們熟知。那么是否還存在另外的轉(zhuǎn)錄因子呢？本篇文章利用單倍體干細(xì)胞以及piggyBac質(zhì)粒操作系統(tǒng)（利用轉(zhuǎn)座子整合進(jìn)入基因組，影響基因組本身基因表達(dá)）對(duì)單倍體胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的陽(yáng)性克隆進(jìn)行遺傳篩選。最終在候選的基因中找到了zfp281轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)手段證明其小鼠和人滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的作用。（Figure 1）

圖 1.  Zfp281足以誘導(dǎo)TS樣細(xì)胞

從文章中我們得知作者利用遺傳篩選手段得到了數(shù)個(gè)候選基因，其中與早期發(fā)育相關(guān)的基因是Zfp281，Rnf11和Mgat1，但是關(guān)于這三個(gè)基因在外胚層中沒(méi)有具體的研究。隨后作者在單倍體胚胎中過(guò)表達(dá)三個(gè)基因發(fā)現(xiàn)，其中只發(fā)現(xiàn)Znf281是主要與滋養(yǎng)層干細(xì)胞維持的重要基因。因此作者隨后將Znf281作為后續(xù)研究方向，研究其具體在滋養(yǎng)層干細(xì)胞中的作用。

作者首先在單倍體胚胎干細(xì)胞中敲除Znf281,隨后利用全長(zhǎng)的Znf281以及缺失鋅指結(jié)構(gòu)域的Znf281進(jìn)行rescue實(shí)驗(yàn)。作者發(fā)現(xiàn)KO組在胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)層干細(xì)胞誘導(dǎo)體系中，滋養(yǎng)層干細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯減少，而rescue組轉(zhuǎn)染完整基因片段的Znf281的一組實(shí)驗(yàn)中，滋養(yǎng)層干細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯變多，而缺失鋅指結(jié)構(gòu)域的Znf281轉(zhuǎn)染沒(méi)有明顯的rescue現(xiàn)象。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了Znf281是胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)層干細(xì)胞發(fā)育的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，而其發(fā)揮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是其存在的鋅指結(jié)構(gòu)域。（圖 2）

圖2.  Zfp281是將ESC有效轉(zhuǎn)化為T(mén)S樣細(xì)胞所必需的關(guān)鍵基因

作者又通過(guò)對(duì)非分化和部分分化小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)Znf281主要大部分表達(dá)在Cdx2中的滋養(yǎng)層干細(xì)胞中表達(dá)，而部分分化的滋養(yǎng)層干細(xì)胞，Znf281的表達(dá)開(kāi)始降低。作者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR同樣證明了這一點(diǎn)。那么在體內(nèi)條件下，Znf281能重復(fù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果嗎？作者檢測(cè)了E6.5和E7.5天小鼠胎盤(pán)Znf281的定位情況。發(fā)現(xiàn)Znf281主要定位在ExE和Epi，而EPC中幾乎不表達(dá)。這同樣說(shuō)明了在體內(nèi)Znf281也是主要表達(dá)在滋養(yǎng)層干細(xì)胞中。另外通過(guò)抑制劑抑制FGF信號(hào)通路的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Znf281表達(dá)同樣受到抑制，說(shuō)明Znf281的表達(dá)受到FGF信號(hào)通路的調(diào)控。（圖 3）

圖 3.  Zfp281以FGF依賴性方式在未分化的小鼠TS細(xì)胞中表達(dá)

為了更進(jìn)一步研究Znf281在小鼠體內(nèi)的作用。作者利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Znf281敲除的小鼠。由于之前有人報(bào)道Znf281敲除鼠在E9.5天致死。作者把取材時(shí)間設(shè)計(jì)在E8.5天至E6.5天。在E8.5天，作者觀察到KO組胚胎結(jié)構(gòu)不完整但內(nèi)胚層發(fā)育看起來(lái)相對(duì)正常，而滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育卻受到明顯影響。接下來(lái)作者更進(jìn)一步觀察E6.5天小鼠結(jié)構(gòu)，同樣得出小鼠胚外外胚層發(fā)育受到影響的結(jié)論。為了驗(yàn)證Znf281具體影響了哪些基因的表達(dá)。作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)比較KO組和WT小鼠之間的區(qū)別。作者發(fā)現(xiàn)KO組小鼠與絨毛膜與迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)受到明顯影響。因此，可以大致得出Znf281與滋養(yǎng)層細(xì)胞分化密切相關(guān)的結(jié)論。（圖 4）

圖 4.  Zfp281 KO影響小鼠胎盤(pán)正常發(fā)育

作者為了更加明確Znf281在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的作用。作者分離出Zfp281KO的TS細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并和之前胎盤(pán)Znf281KO組進(jìn)行對(duì)比找到一致下調(diào)的基因。作者認(rèn)為它們可能是Znf281的靶基因，作者篩選到了Lin28a,Dnmt3L和Foxh1。隨后在蛋白層面上也發(fā)現(xiàn)Lin28a和Dnmt3L水平下降。但是這些結(jié)果只是轉(zhuǎn)錄組水平上的變化，具體關(guān)于Znf281是否真能調(diào)節(jié)這些靶基因，作者利用ChIP-seq進(jìn)一步去驗(yàn)證Znf281直接調(diào)控的靶基因。通過(guò)分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，Znf281能夠調(diào)控的位點(diǎn)大量與組蛋白激活marker重合。比如H3K4me1,H3K4me3和H3K27me3。尤其是與H3K4me1和H3K4me3調(diào)控的peaks能重合80%以上。因此作者認(rèn)為Znf281能夠與H3K4轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物之間存在直接相互作用，事實(shí)上之前已經(jīng)有報(bào)道Znf281能與H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用。這同樣在KO組的H3K4me3實(shí)驗(yàn)結(jié)果中同意佐證了Znf281與H3K4甲基化密切相關(guān)。（圖 5）

圖 5.  Zfp281 調(diào)控滋養(yǎng)層干細(xì)胞基因表達(dá)

另外，作者最后又利用最近分出的人類(lèi)滋養(yǎng)層干細(xì)胞來(lái)看Znf281是否也存在與小鼠相類(lèi)似的表型。雖然小鼠滋養(yǎng)層人類(lèi)干細(xì)胞與人類(lèi)滋養(yǎng)層干細(xì)胞相差比較大，但是通過(guò)在人滋養(yǎng)層干細(xì)胞中敲降Znf281，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)Lin28a和WNT6表達(dá)也是下調(diào)的。說(shuō)明Znf281在哺乳動(dòng)物中調(diào)控機(jī)制應(yīng)該是保守的。從后續(xù)的結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)在人滋養(yǎng)層干細(xì)胞Znf281的作用也是能夠維護(hù)滋養(yǎng)層干細(xì)胞的狀態(tài)。但是與小鼠不同的是，Znf281對(duì)于滋養(yǎng)層干細(xì)胞的分化影響并不是很明顯。

小結(jié)

總結(jié)一下，這篇文章利用多種有效工具篩選到了一個(gè)在小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞維持中有重要的作用轉(zhuǎn)錄因子。雖然這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于滋養(yǎng)層干細(xì)胞作用的維持沒(méi)有之前已報(bào)道的Cdx2的作用那么明顯，但是對(duì)于我們認(rèn)識(shí)小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞的特殊的調(diào)控方式有了進(jìn)一步加深。另外，我們知道小鼠滋養(yǎng)層干細(xì)胞與人滋養(yǎng)層干細(xì)胞的調(diào)控方式相差較遠(yuǎn)。我們對(duì)于人滋養(yǎng)層干細(xì)胞干性維持以及分化的調(diào)控機(jī)制研究相對(duì)很淺。這對(duì)于之后的研究者來(lái)說(shuō)，既是挑戰(zhàn)也是機(jī)遇，尤其隨著人滋養(yǎng)層干細(xì)胞已經(jīng)分離出來(lái)，我們就有了一個(gè)非常適合的研究model進(jìn)行后續(xù)深入研究人滋養(yǎng)層干細(xì)胞的功能。

參考文獻(xiàn)

Ishiuchi T, Ohishi H, Sato T, Kamimura S, Yorino M, Abe S,Suzuki A, Wakayama T, Suyama M, Sasaki H. Zfp281 Shapes the Transcriptome ofTrophoblast Stem Cells and Is Essential for Placental Development. Cell Reports, 2019. 27, 1742–1754