按照下圖所示的操作流程，就可以登錄進(jìn)入無(wú)縫克隆在線設(shè)計(jì)軟件了。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，對(duì)載體的線性化方式進(jìn)行選擇：?jiǎn)蚊盖?、雙酶切和PCR擴(kuò)增，選擇不同的標(biāo)簽，下面的內(nèi)容會(huì)有所不同。

（1）選擇單酶切線性化；

（2）將載體序列粘貼到相應(yīng)的位置。這里要注意，一定要保證所選的酶切位點(diǎn)在我們所輸入的載體序列上是完整的，否則可能不能識(shí)別；

（3）在選擇酶切位點(diǎn)之前，要確定進(jìn)行無(wú)縫克隆時(shí)，是否需要保留線性化載體時(shí)所用的酶切位點(diǎn)，可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇；

（4）選擇我們線性化載體時(shí)所用的內(nèi)切酶，直接點(diǎn)擊就可以彈出下拉菜單，選擇相應(yīng)的內(nèi)切酶即可；

（5）選擇需要插入片段的個(gè)數(shù)，最多可以選擇5個(gè)；

（6）將插入片段序列粘貼到“插入DNA片段”下方的方框中；

（7）點(diǎn)擊下方的“生成引物”即可得到您無(wú)縫克隆所需要的引物；

（8）下圖就是生成的引物序列，將這個(gè)序列復(fù)制下來(lái)就是您的無(wú)縫克隆引物了。

了解了單酶切線性化載體的無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)操作方法，是不是覺(jué)得很簡(jiǎn)單？

下面來(lái)看一下雙酶切線性化載體的無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)操作方法，與單酶切的方法很相似。

（1）選擇雙酶切線性化；

第（2）（3）步與單酶切線性化載體的操作步驟相同。

（4）選擇線性化載體所用的兩個(gè)內(nèi)切酶；

其余的步驟跟單酶切線性化完全一樣，不再贅述。

PCR擴(kuò)增線性化的載體的引物設(shè)計(jì)與前面兩種稍有不同。

（1）選擇PCR擴(kuò)增線性化；

（2）在下方的兩個(gè)方框中分別輸入克隆位點(diǎn)上游序列和克隆位點(diǎn)下游序列，上下游每個(gè)至少要20個(gè)堿基；

（3）選擇需要插入片段的個(gè)數(shù)，最多可以選擇5個(gè)；

（4）將我們的插入片段序列粘貼到“插入DNA片段”下方的方框中；

（5）點(diǎn)擊下方的“生成引物”即可得到您無(wú)縫克隆所需要的引物（圖片展示可參考單酶切線性化、雙酶切線性化載體操作步驟）。

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以上是本期為您介紹的無(wú)縫克隆在線引物設(shè)計(jì)軟件使用指南，希望對(duì)您的實(shí)驗(yàn)所有幫助，下期見(jiàn)！