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基因克隆的引物設計及目的DNA片段的擴增，與常規(guī)PCR法是相同的。唯一的差異在于載體末端和引物末端應具有15-20個同源堿基，由此得到的PCR產物兩端便分別帶上了15-20個與載體序列同源性的堿基。通過相關酶試劑處理，同時除去載體與目的DNA上同源片段的雙鏈中的一條鏈，這樣載體和目的DNA兩端就露出了能夠互補配對的序列，依靠同源序列堿基間的配對能使載體和目的DNA較為緊密的連在一起而無需酶聯(lián)，直接用于轉化。 傳統(tǒng)的PCR產物克隆方法主要有兩種：一種是PCR引物設計時引入載體上的酶切位點，PCR產物經雙酶切后定向克隆到目的載體上；另一種是TA載體連接。這兩種方法費時費力，過程繁冗。 無縫克隆和組裝技術是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內切酶和連接酶。突破傳統(tǒng)的雙酶切再加上連接，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體。 1、位點選擇靈活：載體任意位置基因克?。?/div> 2、快速簡便：省略酶切、割膠回收、酶連等過程，大約1h完成載體構建； 3、精確：不需要增加任何額外的程序； 4、克隆效率高，陽性克隆高達90%以上； 5、一次進行多片段目的基因的重組；   優(yōu)點： · 開放的技術平臺，任何質粒、任意位置、任何目的基因都能適用，位點 選擇靈活。 · 使得PCR產物克隆徹底擺脫了中間載體、重復亞克隆重復篩選的煩惱， 一步進行多片段目的基因的無縫拼接，不受PCR產物末端影響。 · 速度快，操作簡便，重組效率高。 缺點： · 需要通過PCR，目的基因不易在不同載體間穿梭 · 某些時候重復序列或者粘性末端形成的二級結構會影響成功率。 |
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來自： 新用戶8331KT28 > 《無縫克隆》
