盧煜明教授等人在1997年發(fā)現(xiàn)母體血漿中胎兒游離DNA（cffDNA）啟發(fā)了各種非侵入性產(chǎn)前篩查（NIPS）應(yīng)用，避免了侵入性采樣引起流產(chǎn)的風(fēng)險。目前，基于母體血漿中cffDNA分析的常見胎兒非整倍體NIPS已逐漸應(yīng)用于臨床實踐的一級非整倍體篩查策略。以前的大規(guī)模臨床研究表明，在21,18和13三體篩查中NIPS的準(zhǔn)確性很高，敏感性和特異性高于95％。

    重要的是，NIPS的可靠性在很大程度上取決于所測試樣品中是否有足夠的胎兒cffDNA濃度，來自母體外周血中胎兒來源的cfDNA的百分比通常在3-30％的范圍內(nèi)，平均為約13％。cffDNA比例水平由多種因素決定，包括孕齡，母體體重和提取方法，此外，在NIPS的樣本運(yùn)輸或?qū)嶒炇覚z測期間，胎兒比例可能會進(jìn)一步降低。以往的研究表明，妊娠婦女血漿中非整倍體染色體異常的程度與cffDNA比例呈線性相關(guān)，因此，NIPS的測試準(zhǔn)確性很大程度上依賴于胎兒比例。大多數(shù)現(xiàn)行的NIPS操作規(guī)范使用4％作為較低的胎兒比例閾值以確?？煽康慕Y(jié)果。然而，對于早期GA階段的妊娠或需要NIPS的肥胖女性，低胎兒比例是需要克服的主要問題，此外，NIPS錯過約1％染色體非整倍性病例，與這些假陰性結(jié)果相關(guān)的最常見因素是胎兒分?jǐn)?shù)低，基于上述原因，提高胎兒比例以獲得令人信服的NIPS結(jié)果至關(guān)重要。

    cfDNA是由凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的DNA片段，其在快速DNA降解后釋放到循環(huán)中。這些DNA片段的大小分布具有對應(yīng)于核小體（~143 bp）和染色體（核小體+接頭組蛋白; ~166 bp）的峰。在孕婦中，母體外周血中的cffDNA主要來源于穿過胎盤屏障的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，2010年，Lo等人發(fā)現(xiàn)cffDNA與母體細(xì)胞的cfDNA相比具有不同的長度分布， 166 bp的分子比例減少和母體血漿中短于150 bp的分子比例增加，這可能是由細(xì)胞凋亡過程中的差異核小體包裝引起的，或者是由核小體結(jié)合力的差異引起的。基于這些發(fā)現(xiàn)，理論上可以通過大小選擇來富集來自母體外周血中的總cfDNA的cffDNA片段。

    最近南京婦幼保健院許爭峰院長團(tuán)隊與博奧生物合作，開發(fā)了一種cffDNA富集的實驗方法，將cffDNA平均比例提高了1.5-4倍，而獲得的cfDNA完全足夠NIPS。此外，使用這種新方法回顧性地測試了1415個臨床樣本，包括1404個常規(guī)臨床NIPS樣本和11個假陰性NIPS樣本，結(jié)果表明，cffDNA富集策略可以通過減少假陰性結(jié)果以及測試失敗率來改善NIPS的整體性能。相關(guān)結(jié)果于2019年4月11日在線發(fā)表于權(quán)威醫(yī)學(xué)期刊Journal of Translational Medicine。

富集方法

在NIPS文庫構(gòu)建期間，在末端修復(fù)之后和adaptor連接之前進(jìn)行DNA富集。平均粒徑為1μm的磁珠用于選擇小于160bp的末端修復(fù)的DNA片段。為了達(dá)到最高效率，通過測試一系列不同的珠子濃度來優(yōu)化這一步驟。將磁珠加入末端修復(fù)的DNA片段中，然后使管振動至少3秒，然后將管懸浮5分鐘并轉(zhuǎn)移到磁架上。然后將含有大小選擇的DNA片段的上清液轉(zhuǎn)移到另一個管中用于adaptor連接。

結(jié)果

經(jīng)過富集后，小于160bp的片段比例有1.44X-2.64X增加。

分別計算每個bin代表胎兒的染色體Y reads部分，然后將其與10,000 NIPS結(jié)果的匯總數(shù)據(jù)中的部分進(jìn)行比較。 在[100,110]，[110,120]，[120,130]，[130,140]，[140,150]和[150,160]的bin中，平均胎兒比例顯示增加1.98倍，與匯總數(shù)據(jù)中的平均胎兒比例相比，分別為2.42,2.64,2.59,2.01和1.44倍。

使用不同劑量的定制珠粒在尺寸選擇后改變reads長度分布。

重要的是，染色體Y的reads比率也增加了1.5-4倍，最顯著的是1.5倍劑量的珠子（圖1d）。 這些結(jié)果證明，使用1.5倍劑量的珠子的富集程序可以有效地增加cffDNA的比例。

由于cffDNA富集的過程會丟棄大多數(shù)長cfDNA片段，本文量化了富集前后測序文庫的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)輸入cfDNA會減少約91.76％，這是該方法的主要關(guān)注點(diǎn)。但是經(jīng)過實驗驗證，盡管cffDNA富集可以降低輸入DNA的復(fù)雜性，但我們的程序仍然可以從母體血漿中獲得完全足夠的DNA來進(jìn)行NIPS。

在1404個臨床樣本中使用cffDNA富集的NIPS性能

我們首先從1404個樣本中選擇了902個男性胎兒樣本，并通過染色體Y的reads比率計算了他們的胎兒比例。原始NIPS結(jié)果顯示平均cffDNA比例為11.3±4.2％，而NIPS與cffDNA結(jié)果的胎兒比例濃縮增加到22.6±6.6％。

為了證實胎兒部分升高是否確保了臨床樣本的更好表現(xiàn)，我們將新NIPS的1404結(jié)果與cffDNA富集與原始NIPS結(jié)果進(jìn)行了比較，以及確認(rèn)診斷結(jié)果和后續(xù)信息。這些結(jié)果總結(jié)在表1中。簡而言之，最初的NIPS結(jié)果顯示靈敏度為100％（5/5），特異性為99.8％（1394/1397），陽性預(yù)測值（PPV）為62.5％（5/8）。 新的NIPS方法顯示靈敏度為100％（5/5），特異性為99.6％（1394/1399），PPV為50％（5/10）（表1）。 值得注意的是，新NIPS結(jié)果的測試失敗率顯著降低（0.1％vs 0.7％，P<0.01）。

使用cffDNA富集方法對11個假陰性樣品的NIPS性能

在臨床上，NIPS假陰性的原因與低胎兒比例密切相關(guān)。 為了證明新方法是否可以避免假陰性結(jié)果，收集了來自超過常規(guī)100,000例普通NIPS病例的總共11個恢復(fù)的假陰性血漿樣品。通過使用cffDNA富集后的NIPS，胎兒組分顯著增加1.9-2.7倍（P <0.01）。重要的是，11個樣本中有5個（45％）使用新方法返回了陽性結(jié)果（表2），這5個陽性結(jié)果與胎兒的驗證性核型分析結(jié)果一致。 我們的數(shù)據(jù)表明，cffDNA富集可以有效降低NIPS的假陰性率。

結(jié)論

該研究表明通過選擇性富集短cfDNA片段來增加cffDNA比例是可行的。 雖然在NIPS中使用cffDNA富集會略微降低特異性，但這種新方法可以避免大多數(shù)測試失敗的案例，并減少由胎兒低比例引起的假陰性結(jié)果的近一半，從而提高NIPS在臨床上的整體表現(xiàn)，本文的數(shù)據(jù)還表明了將來使用NIPS檢測CNV和單基因疾病的可行性。

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