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過去的十多年間，科學(xué)家們發(fā)明了很多種構(gòu)建克隆的方法。這些方法相較于最經(jīng)典的限制性內(nèi)切酶克隆方法而言，各有優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶克隆技術(shù)，會在兩個(gè)片段的結(jié)合位置上形成一道“疤”或“縫”，這種瑕疵可能會對DNA片段的行為產(chǎn)生微妙的影響。這一點(diǎn)特別令合成生物學(xué)家頭疼，因?yàn)樗麄兂３Ｒ獙幼雍徒K止子這樣的DNA片段轉(zhuǎn)變?yōu)榭深A(yù)測的獨(dú)立元件。今天我們就來說說一種無縫克隆方法。 Gibson組裝 Gibson組裝最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出。Gibson組裝非常適合用于拼接多個(gè)線性DNA片段，當(dāng)然也適合將目的DNA插入載體中。如下圖所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通過PCR法加上）；然后，將這些DNA片段和一種master mix（含有三種酶）混合孵育一個(gè)小時(shí)就可以了。這種master mix含有三種不同類型的酶：
這個(gè)系統(tǒng)最厲害的是，這三種酶都可以在同一個(gè)溫度下很好的發(fā)揮功能，所以整個(gè)反應(yīng)在50攝氏度條件下一個(gè)小時(shí)就可以完成。一小時(shí)后，樣品可以直接用于轉(zhuǎn)化。master mix可以從NEB或者SGI-DNA公司購買，或者直接自己配置，（參見Miller Lab Protocol）。Gibson組裝可以在一個(gè)反應(yīng)中最多拼接6個(gè)DNA片段，無需特定限制性酶切位點(diǎn)。
這項(xiàng)技術(shù)需要通過PCR的方法在DNA片段的兩端加上同源片段，NEB推薦同源片段的長度為15-40bp，同時(shí)要求這部分對應(yīng)的退火溫度高于48攝氏度?，F(xiàn)在假設(shè)一種情境，我們要將一個(gè)目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體上，同時(shí)在這個(gè)目的蛋白的N端融合上一個(gè)大的融合標(biāo)簽，幫助蛋白表達(dá)/檢測/純化。如果按照常規(guī)的限制性內(nèi)切酶克隆方法，一般需要做兩步，先插入一個(gè)基因，測序沒問題后再插入另外一個(gè)基因。而現(xiàn)在如果用Gibson組裝克隆方法，就可以直接一步完成該克隆構(gòu)建。首先我們要需要設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出這兩個(gè)DNA片段，同時(shí)這個(gè)兩個(gè)DNA片段有各有一部分是同源的，這樣便于它們之間進(jìn)行連接；同時(shí)這兩個(gè)DNA片段與載體上各有一部分是同源的，這樣便于它們與載體進(jìn)行連接。然后，兩個(gè)DNA片段進(jìn)行克隆之后，需要進(jìn)行DNA純化。最后將線性化的載體片段，這兩個(gè)DNA片段和Gibson assembly master mix孵育一個(gè)小時(shí)后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。該方法成功率非常高，一般不需要篩選很多克隆就可以拿到正確的克隆。
Gibson組裝克隆法也是有缺點(diǎn)的，缺點(diǎn)之一是適用與長度超過200bp的片段的組裝；缺點(diǎn)之二是如果黏性末端形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)，那么成功率會大受影響。 Gibson組裝克隆法與CRIPSRGibson組裝克隆法與CRIPSR結(jié)合起來會發(fā)生什么反應(yīng)呢？讓我們來看看兩篇文獻(xiàn)報(bào)道，第一篇是Lockey實(shí)驗(yàn)室的（Wang, et al. 2015），文章中他不是用PCR或者限制性內(nèi)切酶來制備線性的質(zhì)粒載體，而是通過Cas9酶的在特定位點(diǎn)的剪切來完成。很明顯，這不是其他方法能夠簡單做到的。第二篇（Jiang et al. 2015）講述的是，利用CRISPR技術(shù)從細(xì)菌的基因組上切了非常大的一個(gè)片段（100kb），然后通過Gibson組裝克隆到載體上。從這兩篇文獻(xiàn)可以看出Gibson組裝克隆法的獨(dú)特優(yōu)勢。 原文地址：http://www./articles/201607211131.html http://blog.sciencenet.cn/blog-3196388-992233.html |
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