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外源基因在大腸桿菌中表達(dá)后常形成不溶性的無(wú)活性包涵體。包涵體的形成已經(jīng)成為研究和應(yīng)用活性蛋白質(zhì)生產(chǎn)的主要障礙。然而，在合適的條件下，包涵體經(jīng)過(guò)溶解、純化、復(fù)性過(guò)程后可在體外重新折疊成有活性的蛋白質(zhì)。 接種隔夜培養(yǎng)的E. coli到5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素），將過(guò)夜培養(yǎng)的重組E. coli按1%的接種量接入200 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素），在37 ℃和220 r/min下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）最終濃度為0.1 mmol·L-1，在37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，并對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)結(jié)束后，離心（8000rpm,10min)收集菌體，收集的菌體用生理鹽水（0.85%的氯化鈉溶液）洗滌2次，然后取適量菌體，用1:10（菌體：緩沖液）的緩沖液重懸菌體，并超聲破碎，破碎后的上清和沉淀分辨SDS-PAGE檢測(cè)his融合蛋白的表達(dá)量及表達(dá)形式。 將培養(yǎng)液4 ℃離心10 min（7000rpm）收集菌體，用PBS緩沖溶液（pH7.5）洗滌菌體。以十倍體積濃縮加入PBS，進(jìn)行超聲波破碎。功率40 W，超聲4 s，間歇6 s，超聲時(shí)間15 min。破碎后的菌液于4 ℃離心10 min（10000 rpm），使包涵體沉淀與可溶性蛋白分離，分別收集沉淀與上清液。 包涵體粗品加入到10ml冷的洗滌液（20 mmol/L Tris－HCl，pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton X-100）中，攪拌20min。4℃，12000rpm離心25min，棄上清，取沉淀。重復(fù)一次（洗滌2～4h去除膜碎片和膜蛋白）。所得沉淀再用50mmol/L Tris-HCl洗1次（以去除殘留的EDTA），相同離心條件，離心棄去上清，所得的沉淀即為洗滌后的包涵體。 ?包涵體在溶解之前需要進(jìn)行洗滌，包涵體主要含有重組蛋白，但也有一些雜質(zhì)，如一些外膜蛋白、質(zhì)粒DNA等，這些雜質(zhì)會(huì)與包涵體黏連在一起，可以通過(guò)洗滌除去大多數(shù)雜質(zhì)，但無(wú)法將雜蛋白去除干凈。包涵體的洗滌通常選用濃度較低的變性劑，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5,1mM EDTA中洗滌包涵體。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌除去膜碎片和膜蛋白。同時(shí)因?yàn)槿ス竸┑南礈炷芰?huì)隨溶液離子強(qiáng)度升高而加強(qiáng)，所以在洗滌包涵體時(shí)可以加入低濃度的尿素或高濃度的NaCl，使包涵體的純度達(dá)50%以上。 將上述沉淀加入10ml包涵體變性溶解液重懸（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，6 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或1 mmol/L β-巰基乙醇，2％Triton），于室溫?cái)嚢?0-60min以充分溶解，4℃ 12000rpm離心15min，棄沉淀取上清。將上清用0.22um或0.45um濾膜過(guò)濾。 ?變性劑如尿素、鹽酸胍，主要是通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽延伸。用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀，溶解的包涵體可選用多種色譜法純化，較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%。鹽酸胍是較強(qiáng)尿素變性劑，它能溶解尿素不溶的包涵體，溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白的共價(jià)修飾，成本高，在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀，復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀，對(duì)蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等也可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。另外，從某些含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)中分離出包涵體，通常含有一些鏈間二硫鍵和鏈內(nèi)非活性二硫鍵，這就需要加入還原劑，如巰基乙醇，二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤癬糖醇、半胱氨酸等。這種還原性試劑能夠同半胱氨酸形成二硫化物中間體，也會(huì)被復(fù)性用的二硫化物置換試劑所取代。二硫鍵的形成和斷裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫鍵形成，這個(gè)平衡才會(huì)被破壞。 取5-10ml變性上樣緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，6 mol·L-1尿素，5mM·L-1咪唑，1mM·L-1巰基乙醇，pH=8.0）平衡 Ni Focurose 6FF（IMAC)-武漢匯研生物,聯(lián)系微信514099167）柱，流速為0.5 mL·min-1。將經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后包涵體溶解液上樣，流速為0.5 mL·min-1。取10ml洗滌緩沖液（20mM·L-1 Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，6 mol·L-1尿素，5mM·L-1咪唑，1mM·L-1巰基乙醇，pH=8.0）洗柱，直至OD280不再變化，流速為0.5 mL·min-1。依次以含有5、4、3、2、1、0 mol·L-1尿素的復(fù)性緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，0.1 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽，1 mmol·L-1 還原型谷胱甘肽，pH8.0）洗柱，每個(gè)梯度10 mL，流速為0.2 mL·min-1。再以含有400 mmol·L-1咪唑的復(fù)性緩沖液洗脫，流速為0.5 mL·min-1，復(fù)性過(guò)程中OD值隨時(shí)間的變化，并收集各階段洗脫液，4 ℃離心10 min（10 000 r/min），取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。將不含尿素的洗脫液用熒光法測(cè)酶活。 |
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