關(guān)于包涵體的復(fù)性一直是生物制藥的瓶頸，包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純化。

一、包涵體蛋白的表達(dá)
在平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到100 ml LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至A600 為0.4~0.6時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.5

mmol/L 誘導(dǎo)3.5 h。8000 r/min 離心5 min 收集菌體，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超聲波破碎后12000 r/min離心30 min收集沉淀。

二、包涵體的洗滌
在包涵體中加入包涵體洗滌液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振蕩洗滌1～2 h，然后8 000 r/min 離心15 min，收集沉淀。

三、包涵體的溶解
洗滌后的包涵體加入適量的(包涵體溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用時(shí)現(xiàn)加)，于磁力攪拌器上攪拌過夜，1000 r/min離心30 min，取上清即得包涵體溶解液。

四、包涵體的復(fù)性
包涵體的復(fù)性目前常用的主要有兩種方式：1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋；2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑。

1.包涵體的稀釋復(fù)性
設(shè)定不同的復(fù)性條件：蛋白質(zhì)量濃度、尿素濃度、溫度、氧化還原條件、加入Ttiton X-100與環(huán)糊精的量、復(fù)性時(shí)間等，使變性溶解的包涵體稀釋復(fù)性，復(fù)性一定時(shí)間后取樣測(cè)酶活性。

2.包涵體的透析復(fù)性
包涵體蛋白的復(fù)性將8 mol/L 尿素溶解后的樣品裝入透析袋，密封置于復(fù)性液I（0.2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；5%甘油；5 μmol/L EDTA；pH8.5），4 ℃
透析12 h 后再轉(zhuǎn)入復(fù)性液II（0.2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L NaCl；）4 ℃ 透析12 h，12000 r/min 離心30 min，收集上清進(jìn)行蛋白濃度及活性測(cè)定。

復(fù)性前對(duì)蛋白的性質(zhì)一定要清楚：
1. 蛋白預(yù)期的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是些什么。一般來說beta sheet占多數(shù)的蛋白較易復(fù)性
2. 蛋白pI
3. 氨基酸組成，比如有沒有cystine
4. 有沒有底物？如果有結(jié)合的ligand之類，通常加入后會(huì)有所幫助，
5. 一般尿素中含有非常高的一種雜質(zhì)（暫時(shí)記不起什么名字了，如果樓主一定要請(qǐng)回帖我再找找），當(dāng)達(dá)到8 M的時(shí)候雜質(zhì)的濃度也很大了。有的實(shí)驗(yàn)室會(huì)先純化一下尿素，然后再溶解，有的直接先試GuHCl
6. 復(fù)性一般是梯度稀釋，或者梯度透析，或者在柱上緩慢降低Urea，一下子降低太快（你的復(fù)性液）可能也是原因之一。
7. 鹽濃度是否可以再高些？一般可以達(dá)到0.5 M，如果有更好的鹽（如果這個(gè)蛋白的生化性質(zhì)比較了解的話，應(yīng)該再加入一些別的鹽）
8. 一般會(huì)有Glycerol
9. 一般會(huì)有Arginine或者glycine

雖然復(fù)性成功的例子很多，但是還是建議首先嘗試更換載體：pet32a、PGEX、Pmal都有可能促進(jìn)蛋白可溶，由包涵體表達(dá)變成可溶表達(dá)。畢竟復(fù)性的條件很難摸索，成功的概率太小，浪費(fèi)的時(shí)間也太多。