圖片來(lái)源：《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》^[1]

外顯子（exon）通常是指基因內(nèi)的DNA編碼序列，并且最終表達(dá)為蛋白質(zhì)。外顯子組是指物種基因組中所有外顯子區(qū)域的總和。人類外顯子組包括22,000余個(gè)基因，共180,000余個(gè)外顯子。整個(gè)外顯子區(qū)域長(zhǎng)度只有全基因組的1-2%^[2]，但是卻涵蓋了大多數(shù)的單基因病致病突變^[3]。

目前，NGS應(yīng)用在臨床科研中主要用于尋找疾病在分子層面的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因的測(cè)序來(lái)發(fā)現(xiàn)新的基因或突變類型，并輔以功能驗(yàn)證或者大樣本數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，揭示基因與疾病、基因型與表型之間的關(guān)系。

之前很多與遺傳病診斷相關(guān)的科研文章，由于是借助Panel分析的，大多是關(guān)于某一明確致病基因的新的變異類型或者基因型與表型的突變譜的研究，局限性比較強(qiáng)。在一些明確致病基因的回顧性研究中，Panel具有很好的性價(jià)比。

但是，在科研的探索之路上，一次性所能得到的信息越多，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲性O(shè)計(jì)和分析，我們就越能揭開(kāi)疾病最里面的那層面紗。一項(xiàng)產(chǎn)品是否真的適合應(yīng)用在科學(xué)研究中，最重要的就是看它的潛力，在遺傳病領(lǐng)域中，這個(gè)潛力就是發(fā)現(xiàn)新的致病基因。

下面來(lái)看下相關(guān)潛力分析。

圖片來(lái)源：OMIN

截止今年7月8號(hào)，OMIM中有5582種疾病與基因明確關(guān)聯(lián)，仍然有1560種疾病沒(méi)有明確基因關(guān)聯(lián)。人類目前一共有20000余個(gè)基因，在OMIM中有描述的也只有16112個(gè)基因，因此，一次性檢測(cè)所有基因的外顯子區(qū)域?qū)τ谛碌闹虏』虻陌l(fā)現(xiàn)還是非常有意義的。

下面我們就用近期發(fā)表的一些文章來(lái)看看WES在發(fā)現(xiàn)新的致病基因等科研發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。

先看今年四月份發(fā)表在頂級(jí)醫(yī)學(xué)雜志《The New England Journal of Medicine》上的一篇文章。

圖片來(lái)源：The New England Journal of Medicine

先天性巨結(jié)腸是一種腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病，是新生兒和嬰兒腸梗阻最常見(jiàn)的原因。這類疾病具有80%以上的遺傳性，包括一些與腸道神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的罕見(jiàn)和常見(jiàn)的基因序列變異或者是一些腸神經(jīng)發(fā)育受累及的單基因遺傳病或染色體綜合征。作者通過(guò)對(duì)190名患者進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序以及基因分型，從單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異到核型變異，來(lái)尋找先天性巨結(jié)腸的分子學(xué)機(jī)理^[4]，通過(guò)WES的檢測(cè)，在入組患者中一共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)疾病相關(guān)的新致病基因。

圖片來(lái)源：The New England Journal of Medicine

第二篇為2016年發(fā)表在《The New England Journal of Medicine》的文章。

作者對(duì)患有神經(jīng)代謝紊亂的47個(gè)患兒進(jìn)行WES測(cè)序（其中6例落選、1例退出研究），對(duì)得到的41個(gè)患兒的WES測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定出2個(gè)新致病基因、22個(gè)基因的變異新增相關(guān)表型，9個(gè)基因的變異的表型與預(yù)期一致，并且其中28個(gè)患兒已經(jīng)得到明確診斷，18個(gè)患兒已經(jīng)得到了針對(duì)性干預(yù)性治療實(shí)驗(yàn)^[5]。

圖片來(lái)源：The New England Journal of Medicine

無(wú)需大量樣本的累積，只需要單個(gè)罕見(jiàn)家系就可以鑒定出新的基因，期待每一位臨床醫(yī)生都能有這樣的運(yùn)氣，下面來(lái)看實(shí)例：

圖片來(lái)源：Journal of Clinical Medicine

上文發(fā)表在《Journal of Clinical Medicine》,IF:5.6。自閉癥譜系障礙（ASD）是一組具有高遺傳性的神經(jīng)發(fā)育障礙，盡管其潛在的遺傳因素仍然沒(méi)有研究透徹。作者通過(guò)全基因組拷貝數(shù)變異分析和整個(gè)外顯子組測(cè)序（WES）分析來(lái)自撒丁島的兩個(gè)ASD兄弟的全面遺傳表征，鑒定與該病癥相關(guān)的新的遺傳改變。單核苷酸多態(tài)性（SNP）陣列數(shù)據(jù)揭示了兄弟姐妹中涉及CAPG，ELMOD3和SH2D6基因的罕見(jiàn)微缺失。WES分析導(dǎo)致在受影響的兄弟姐妹中識(shí)別VDAC3中罕見(jiàn)的移碼突變，這是一種不能喪失功能突變的基因，編碼位于PSD上的電壓依賴性陰離子通道。此外，在對(duì)PSD蛋白的功能變異編碼喪失的基因中鑒定出四種錯(cuò)義損傷變體：PLXNA2，KCTD16，ARHGAP21和SLC4A1。該研究將CAPG和VDAC3鑒定為候選基因，并為編碼ASD易感性中PSD蛋白的基因提供額外支持證據(jù)^[6]。

最后來(lái)看一篇2016年發(fā)表在《The New England Journal of Medicine》上的文章，這篇文章堪稱單個(gè)家系發(fā)現(xiàn)新的致病基因并進(jìn)行驗(yàn)證的教科書。

來(lái)自中美兩國(guó)學(xué)者在新英格蘭雜志上聯(lián)合發(fā)布的一篇關(guān)于發(fā)現(xiàn)阻礙人卵母細(xì)胞分裂的新基因TUBB8。該研究先是對(duì)一個(gè)患有不孕癥的超大家系中5名家庭成員進(jìn)行全外顯子檢測(cè)，包括3名不孕患者。再找到備選基因TUBB8后，對(duì)該3名患者及其他家庭成員還有另外23個(gè)患病家庭進(jìn)行Sanger驗(yàn)證。最后通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)TUBB8的表達(dá)及其同型β-微管蛋白在人類卵母細(xì)胞、早期胚胎、精子細(xì)胞和一些體細(xì)胞組織中進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定。最后得出TUBB8突變體會(huì)導(dǎo)致女性不孕^[7]。

圖片來(lái)源：The New England Journal of Medicine

這里給臨床醫(yī)生總結(jié)了一些科研的小貼士：

1、遇到高度懷疑遺傳導(dǎo)致的疾病，但WES臨床報(bào)告顯示為陰性的報(bào)告不要?dú)怵H，很可能新的致病基因在萬(wàn)千variants中等你找到它并驗(yàn)證它；

2、單個(gè)家系直接找到新基因太考驗(yàn)運(yùn)氣，不如試試多積累些樣本進(jìn)行隊(duì)列分析；

3、如果你的樣本在做了WES和CMA（CNV-seq亦可）后仍未發(fā)現(xiàn)有意義的突變，可以嘗試WGS或者三代測(cè)序；

4、一些特殊類型的突變，如動(dòng)態(tài)突變（脆X綜合征）、存在高度同源性的假基因的疾病（先天性腎上腺皮質(zhì)增生）等，是不適用于NGS測(cè)序的，要選擇對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法才能正確檢出；

5、當(dāng)常規(guī)NGS遇到瓶頸的時(shí)候，有可能跟表觀遺傳學(xué)相關(guān)，一些甲基化芯片或者甲基化NGS等也是不錯(cuò)的選擇；

6、科研需趁早，也許今年20個(gè)樣本就能發(fā)3分，到明年想發(fā)3分就要50個(gè)樣本了，攢樣復(fù)攢樣，不如分秒必爭(zhēng)多收集相關(guān)疾病樣本進(jìn)行研究。

最后祝各位臨床醫(yī)生投稿必中，中必高分！