很多情況下，為了研究自噬參與某個(gè)生物學(xué)過程的機(jī)制，比如要證明某種處理（藥物、基因等）通過改變自噬流進(jìn)而影響某種表型，我們可以敲除掉自噬關(guān)鍵基因的細(xì)胞系抑制自噬流的形成，再用該處理處理細(xì)胞，則應(yīng)該看不到表型的變化，或者變化會(huì)相應(yīng)的減弱。這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以證明自噬確實(shí)參與或影響該種表型。

在這種背景下，研究者往往會(huì)選擇參與自噬囊泡形成的相關(guān)基因，如    ATG5\ATG13\ATG16L1\SQSTM1\ATG7\ATG14\RB1CC1\ULK1\ATG12等，進(jìn)行干預(yù)。其中，ATG7作為泛素樣激活酶（E1-like）、ATG10作為泛素樣結(jié)合酶E2（E2-like）依次參與催化ATG12共價(jià)連接到ATG5。 ATG12-ATG5共價(jià)復(fù)合物一起作為泛素樣連接酶E3（E3-like）催化ATG8（LC3）家族蛋白的剪切、脂化（共價(jià)連接到自噬小體的膜上），最終參與自噬囊泡的形成（圖1）。

所以，如果干擾ATG5、ATG12、ATG7或者ATG10等核心基因的表達(dá)，會(huì)顯著抑制自噬囊泡的形成，抑制自噬流的發(fā)生。實(shí)例如圖8，野生型的U2OS-LC3-GFP細(xì)胞內(nèi)，使用氯喹抑制溶酶體活性會(huì)顯著增加自噬小體的數(shù)量；但對(duì)于轉(zhuǎn)染LC3-GFP ，并且敲除ATG5基因的U2OS-細(xì)胞，無論是否用氯喹處理，均觀察不到明顯的自噬小體。這提示ATG5在自噬體形成過程中扮演重要的角色。

圖2，U2OS細(xì)胞敲除自噬關(guān)鍵基因ATG5后會(huì)抑制自噬。在野生型和ATG5敲除的U2OS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LC3-GFP病毒48hr，然后用15 μM chloroquine 再處理 24 hr，指示自噬體的綠色小點(diǎn)的數(shù)量明顯減少。

除了主流的定位示蹤工具LC3和P62之外，漢恒公司還擁有多種自噬相關(guān)基因的過表達(dá)載體，常見的ATG5、ATG10、ATG7、ATG12、ATG13、ATG16L1、ATG14、RB1CC1（即ATG17）、ULK1（即ATG1）、以及線粒體相關(guān)基因Parkin、Bnip3、Nix、FUNDC1等，每個(gè)基因均有過表達(dá)的質(zhì)粒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒現(xiàn)貨，包含人、大鼠、小鼠等常見物種。

現(xiàn)貨產(chǎn)品表：

除了以上的以降解非特異性的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物為特點(diǎn)的經(jīng)典自噬外，研究人員也越來越關(guān)注細(xì)胞器參與的選擇性自噬，包括線粒體自噬、脂滴自噬 、核糖體自噬、過氧化物酶體自噬、染色體自噬等。其中最具代表性的例子就是線粒體自噬（Mitophagy）。

線粒體自噬是細(xì)胞在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激等壓力條件下一種基本的生物學(xué)現(xiàn)象，通常會(huì)把多余的或者受損的線粒體通過自噬途徑降解掉，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。一個(gè)事實(shí)：如果細(xì)胞線粒體發(fā)生自噬，則線粒體一定會(huì)和自噬小體有空間上的接觸。如用線粒體解偶聯(lián)試劑CCCP處理細(xì)胞會(huì)顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬。

所以，基于這種合理的假設(shè)，我們只需分別標(biāo)記線粒體和自噬小體，然后觀察二者有無共定位，從而判斷有無線粒體自噬或線粒體自噬強(qiáng)弱。

如下圖3所示，我們用自噬小體單標(biāo)工具LC3-GFP標(biāo)記自噬小體，用mito-RFP標(biāo)記線粒體。我們發(fā)現(xiàn)chloroquine處理會(huì)顯著增加線粒體和自噬小體的共定位，說明該過程有線粒體自噬發(fā)生。不僅可以檢測(cè)離體細(xì)胞的線粒體自噬，LC3-GFP和mito-RFP標(biāo)記工具也可以用來檢測(cè)活體動(dòng)物的線粒體自噬。

圖3，線粒體和自噬小體的共定位。用mito-RFP（紅色）和LC3-GFP（綠色）分別標(biāo)記自線粒體和噬小體。其中上排A代表對(duì)照，下排B代表用CCCP和Chloroquine處理。

類似的，我們可以通過觀察他細(xì)胞器跟LC3-GFP共定位的情況來考察這些細(xì)胞器在某些處理?xiàng)l件下是否參與自噬的發(fā)生。常見的還有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER、高爾基體Golgi、脂滴、染色體等（圖4）。

圖4，LC3-GFP標(biāo)記的自噬小體和RFP標(biāo)記的其他細(xì)胞器的關(guān)系。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染LC3-GFP與（A）線粒體定位的RFP（mito-RFP）、（B）高爾基體定位的RFP（Golgi-RFP）、（C）溶酶體定位的RFP（Lyso-RFP）、（D）ER定位的RFP（ER-RFP），分別指示了線粒體、高爾基體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與參與自噬的發(fā)生。

漢恒生物擁有多種細(xì)胞器定位的工具病毒現(xiàn)貨，包含：線粒體、高爾基體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，可以和LC3單熒光標(biāo)記的腺病毒（AD-GFP-LC3）配合使用，用來觀察細(xì)胞器的自噬情況：

今天的內(nèi)容就是這些，下期我們將介紹：其他細(xì)胞器的自噬研究和自噬流熒光數(shù)據(jù)的處理。