  實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ Real-Time qPCR）是分子生物學(xué)最常用的一種方法，它無疑是每個(gè)生物實(shí)驗(yàn)者的必備技能！然而對于大多初入實(shí)驗(yàn)的小白來說，qPCR真的一點(diǎn)都不Q，想要做出完美的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需要過關(guān)斬將、披荊斬棘、克服重重困難！ Never mind！ 本帖跟隨小麥探索qPCR內(nèi)心世界！ 1 qPCR基本原理 在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)發(fā)展非常迅速。 視頻講解： qPCR介紹-Introduction to qPCR   專業(yè)英語Tips 模板 template ，序列 sequence 檢測 detect， 靈敏 sensitive 2 qPCR應(yīng)用 目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動(dòng)物疫病檢測等，還包括： ● 基因擴(kuò)增 ● 擴(kuò)增特異性分析 ● 基因定量分析 ● 基因檢測 ● 基因分型 ● SNP分析 ● RFLP多態(tài)性分析 ● 單/多基因表達(dá)研究 ● 高通量基因表達(dá)譜研究 …… 3 qPCR常用方法 染料法 熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，每個(gè)循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時(shí)，其缺點(diǎn)也在于其非特異性。當(dāng)PCR反應(yīng)中有引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增時(shí)，該染料也可以和這些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光，從而干擾對特異性產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。 常用的染料為SYBR Green I，各公司針對熒光信號強(qiáng)度、抑制作用等進(jìn)行改進(jìn)，也推出了很多新的染料供大家選擇。 Promega采用新型熒光染料BRYT Green? Dye，對qPCR反應(yīng)沒有抑制作用，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號更強(qiáng). 探針法 在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。 下表對兩種方法進(jìn)行對比：
視頻講解： 染料法vs探針法-qPCR:Dye vs Probe 實(shí)驗(yàn)室小工具 專業(yè)英語Tips 溶解曲線 melt curve ， 變性 denature 報(bào)告分子reporter ，猝滅劑 quencher 4 qPCR一般步驟 提取RNA ——RT-PCR ——以cDNA為模板檢測 Real-Time qPCR MasterMix一般為預(yù)混液，只需要加入模板和引物就可以。在操作過程中，還需要根據(jù)所用Master Mix、模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個(gè)最佳反應(yīng)體系。 參比染料（reference dye）的作用是校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇。 由于進(jìn)行qPCR前需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇1步法（RT-PCR和qPCR在同一管中進(jìn)行）或2步法（RT-PCR和qPCR分開進(jìn)行）。 下表為大家總結(jié)了兩種方法如何選擇及優(yōu)勢：
視頻講解： 一步法vs兩步法-1step vs 2step 實(shí)驗(yàn)室小工具 GoTaq? Probe 1-Step RT-qPCR System GoTaq? Probe 2-Step RT-qPCR System 專業(yè)英語Tips 逆轉(zhuǎn)錄酶 reverse transcriptase 熱循環(huán) thermal cycling 5 qPCR常見參數(shù) 基線(baseline)：通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號 閾值(threshold)：自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35 Rn(Normalized reporter)：熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。 △Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果  qPCR定量方法 絕對定量和相對定量的區(qū)別在于，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個(gè)樣本中的拷貝數(shù)。絕對定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 |
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