老司機教你玩轉(zhuǎn)神經(jīng)元Sholl Analysis-Image J

小夢想在努力 2019-10-05

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Sholl Analysis是分析神經(jīng)元復雜性的經(jīng)典方法，下圖是Nature Communications使用商業(yè)化軟件Neurolucida software進行Sholl Analysis 的圖片：

一、什么是Sholl Analysis？

Sholl Analysis 以神經(jīng)元胞體為圓心（不包括胞體）開始畫一系列同心圓（如b圖右上角示意圖所示），得到隨離胞體距離變化的神經(jīng)元突起交點（Intersections/Crossings）個數(shù)，以此來反映神經(jīng)元的復雜性。上圖結果顯示從離胞體大概80-200μm處LHF: light off組神經(jīng)元復雜性高于比Ctrl: light off與LHF: light on組。除分析高爾基染色外，Sholl Analysis還可以分析免疫熒光標記的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞的復雜性。

問題來了，如果沒有商業(yè)化軟件是不是就不能完成Sholl Analysis？

當然不是。美國NIH開發(fā)了一款功能強大且適用于多種電腦操作系統(tǒng)的免費軟件——ImageJ，該軟件也可進行Sholl Analysis。今天老司機就手把手給大家分享使用ImageJ進行Sholl Analysis！

二、ImageJ軟件、Sholl Analysis插件下載與安裝

ImageJ/Fiji是預捆綁了許多常用插件的ImageJ，下載鏈接：http:///Fiji/Downloads。

Sholl Analysis插件下載鏈接：http:///Sholl。

Fiji軟件已安裝Sholl Analysis插件，Analyze -> Sholl處可見：

其他版本ImageJ則需將下載Sholl Analysis插件放置Plugins文件夾下，重啟ImageJ軟件Analyze -> Sholl處可見Sholl Analysis：

三、Sholl Analysis詳細步驟

1、ImageJ軟件打開神經(jīng)元圖片，Image -> type -> 8-bit將圖片轉(zhuǎn)換為8-bit灰度圖片。如圖片為多通道熒光圖片則需先通過Image -> Color -> Split Channel拆分為灰度圖片。

Process -> Binary -> Make Binary，使神經(jīng)元變化二值化圖片：

2、使用ImageJ直線工具以神經(jīng)元胞體中心為起點向最長突起處畫直線：

3、Analyze -> Sholl -> Deprecated -> Sholl Analysis，進入Sholl Analysis參數(shù)界面：

Definition of Shells可設置開始Sholl分析的半徑（即胞體的大小），Ending radius為最長突起的位置即Sholl分析結束的半徑，Radius step size設置兩個分析半徑之間的步進：

Output Options可以設置導出結果，包括Intersections mask與顯示在分析圖像上顯示交點與同心圓：

Intersections mask為偽彩圖片，顏色深淺代表交點數(shù)（也有文獻稱為Branches，等同有分支才會有交點）。點擊Analyze -> Tools -> Calibration Bar可以添加bar，設置bar位置（Location）、顏色、字體大小等，點擊OK即可，可見最多交點為43個：

4、Sholl Analysis結果解讀

除得到Intersections mask與顯示在分析圖像上顯示交點與同心圓外還可以得到多種數(shù)據(jù)。

交點數(shù)目的Semi-log plot，交點數(shù)目被歸一化到每個交點數(shù)目對應Sholl分析面積。兩條回歸線表明，回歸線即可以擬合到所有數(shù)據(jù)點（藍色直線），也可以擬合在10-90百分位的子集（紅色直線）。R²為決定系數(shù)，L是Sholl回歸系數(shù)。List可查看并保存數(shù)據(jù)。

Sholl Analysis還可以得到Sholl Profiles，包括不同半徑對應的交點數(shù)、交點數(shù)的多項式擬合、交點數(shù)/面積等繪圖數(shù)據(jù)：

Sholl Analysis最重要的數(shù)據(jù)是得到隨離胞體距離變化的神經(jīng)元突起交點（Intersections/Crossings）個數(shù)：

上圖每個小十字架為對應分析半徑的實際交點數(shù)目，藍色曲線為對2D distance與交點數(shù)目進行多項式擬合的曲線。R2為擬合曲線與散點的相關性為0.984，右上角還有一些數(shù)據(jù)可由下圖進行逐一解釋：

Max：實際交點數(shù)最大的位置。

N_m：臨界值，即擬合曲線最高點對應的交點數(shù)，對應的Sholl半徑為臨界半徑r_c。

N_av：指所有交點的平均值。

曲線中心的x為分析形狀的質(zhì)心所在位置。

RI_max：實際交點數(shù)最大值與Starting radius交點數(shù)目/分枝數(shù)的比值。RI_Nm為交點臨界值交點數(shù)與Starting radius交點數(shù)目/分枝數(shù)的比值。

點擊List可查看并保存Sholl profile （Liner） for 神經(jīng)元數(shù)據(jù)：

5、導出數(shù)據(jù)Graphpad Prism重新繪圖

導入保存數(shù)據(jù)：

選擇繪制折線圖：

得到兩根折線圖：

雙擊折線，進入Format Graph界面。Data set選擇Data 1: Data Set-A，勾選Show symbols，Shape設置為十字，Size為2，Border color為Gray：

同時勾選掉Show connectingline/curve，即不顯示連接線，點擊OK：

得到與ImageJ軟件類似的圖片：

每組Sholl分析多張神經(jīng)元后即可得到文獻中類似的Sholl分析結果圖：

今天給大家分享使用ImageJ進行Sholl Analysis就到此為止了，希望對大家有所幫助！

參考文獻：

Yang Y, Wang ZH, Jin S, et al.Opposite monosynaptic scaling of BLP-vCA1 inputs governs hopefulness- andhelplessness-modulated spatial learning and memory. NatCommun. 2016
Binley KE, Ng WS, Tribble JR, SongB, Morgan JE. Sholl analysis: a quantitative comparison of semi-automatedmethods. J Neurosci Methods. 2014