Golgi Staining操作和數據分析

桔梗下的小金魚 2022-02-13

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入門指南

Golgi-Cox浸染法是研究神經元和膠質細胞正常和非正常形態(tài)最有效的方法之一。使用Golgi技術，在藥物處理過的動物腦中和因神經疾病死亡的病人腦中發(fā)現了神經樹突和樹突微小的形態(tài)改變。

Part A 高爾基染色

原理：用重鉻酸鉀和鉻酸鉀，氯化汞作為初步固定劑浸潤組織，鉻鹽和神經細胞中的蛋白質結合，氯化汞通過白色沉淀來標記單個細胞，進一步經過堿處理，使沉淀物變黑（硫化汞）。該法最顯著的特點是其反應終產物都局限于單個神經細胞的內部，而其周圍去多類似的神經細胞不著色，從外觀上看，就好像從固定到脫水的全過程在細胞膜水平都存在一個阻止可見產物擴散的屏障。

The beauty of the method lies in one of its shortcomings: the Golgi protocol stains only a few hundred neurons out of the millions present. Thus, it is possible to visualize neurons and trace their path and connections in the brain against a pale yellow background with unsurpassed clarity. Without this ability to stain the few select neurons, everything would have looked like a large black blob on the brain section.。

1.明膠玻片的制備

高爾基染色的腦片較厚，如果使用普通玻片貼片，在染色過程中，腦片很容易從玻片上脫落下來，影響實驗結果，對此需制備特殊明膠包被載玻片，以供高爾基染色使用。

方法：加熱500 mL雙蒸水，后加入10g明膠，攪拌溶解。待溶解后加入0.5g硫酸鉻鉀，攪拌溶解（此步驟需在通風櫥內進行），定容至1L，過濾冷卻至室溫。將干凈的玻片浸入溶液當中，避免氣泡形成。37 °C烤干玻片。烤干后4℃保存。

2.腦組織標本收集

2.1在取腦前24小時提前等量混合A,B液，并不能攪拌。制備好的浸泡液在用之前室

溫黑暗保存可長達一個月。每cm3待研究組織至少用5ml浸泡液。注意用較少的浸

泡液可能降低染色的靈敏性和可靠性。

2.2殺死動物之前對實驗動物進行深度麻醉。應盡快地從顱骨中取出動物的腦（或死去

病人的腦），但操作時必須非常小心以免損傷或壓迫組織。

2.3用雙蒸水快速沖掉組織表面的血液。

2.4把組織浸泡在由溶液A和B等體積混合的浸漬液中，室溫下黑暗保存兩周*。浸泡

6個小時以后或次日更換新的浸漬液。

2.5轉移組織到溶液C中室溫黑暗至少72小時（可長達1周）。24小時后或次日至少

更換一次溶液。

3.冰凍切片

3.1 從C溶液中去除組織，擦除表面液體，置于-24℃切片機中的樣本盤上滴加雙蒸水

包被冰凍。

3.2 使用修塊（Trim）模式進行切片，切片厚度100-150 um，按實際需要調整切片溫度。

3.3 在寫好標記的載玻片上滴一滴C液，可用毛筆涂開。用玻璃分針把樣本轉移到玻片

上，使之在C液中展開，注意腦片與載玻片中間不能留有氣泡。載玻片上多余的溶液用吸管吸走并用濾紙吸干（載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻片上脫落下來）。切片可以室溫下自然風干（不能用電風扇或電熱板使其干燥）。為取得最佳結果，應盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中，室溫黑暗條件下

最長可保存3天。

4.高爾基染色

在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干

4.1 用雙蒸水沖洗切片兩次，每次4分鐘。

4.2 堿化：把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的雙蒸水組成的混合液中10分

鐘。比如：溶液D 10ml 溶液E 10ml 雙蒸水 20ml

注意工作液最好現配現用，每100ml工作液最多用于100張切片（比如小鼠腦），根據切片的大小。盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發(fā)。為取得最佳結果，孵育期間應頻繁攪拌工作液。

4.3 用蒸餾水沖洗切片兩次，每次4分鐘（蒸餾水應頻繁更換新的）。

4.4 在50%，75%和95%的乙醇中對切片進行脫水，每個濃度梯度脫水4分鐘（不要跳過

任何一個步驟）。

4.5 然后在無水乙醇中對切片進行脫水，4次，每次4分鐘（不要延長時間）。

4.6 在二甲苯中透明，3次，每次4分鐘，并且用樹脂封片劑對蓋玻片進行封片。

4.7 避光晾干，拍照進行數據分析。

Part B 高爾基染色神經元數據分析

高爾基染色統(tǒng)計數據主要反映在樹突復雜性(dendritic complexity)。統(tǒng)計數據有樹突分支數（number of dendritic branch）、樹突長度（dendritic length）、樹突棘密度（dendritic spine density）等。使用ImageJ及一些相關圖像處理軟件，可以初步統(tǒng)計以上數據。

ImageJ 是一個基于java 的公共的圖像處理軟件，它是由National Institutes of Health 開發(fā)的。ImageJ 能夠顯示，編輯，分析，處理，保存，打印8 位，16 位，32 位的圖片，支持TIFF,PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS 等多種格式。ImageJ的很多功能都是通過插件來實現的。比如NeuroJ插件就是用來統(tǒng)計神經元樹突長度的，Sholl Analysis插件用來統(tǒng)計神經元分支數。

本文中還用到了NeuronStudio和Photoshop等圖像處理軟件。

1.樹突長度和分支數分析

1.1拍照

在目標區(qū)域選取的神經元，結構應清晰可見，與其他神經元交集較少，便于分析。

由于受切片厚度影響，盡量選取完整的神經元。選好目標神經元后在X200物鏡下

拍照。為了盡量使用2D照片還原立體的神經元，故應不斷調整焦距拍照，盡量將

單個神經元全貌的各個細節(jié)拍下，便于分析?？擅啃⒔?°拍下一張照片，依次

可拍下該個神經元的一批照片。注意保存標尺，方便后續(xù)分析。

2．I mageJ圖片初步處理

2.1.1 打開文件，File→Import→Image Sequence，點擊目標文件夾中的一張照片從而選中全套照片，在Sequence Option對話框中點擊OK。即可得到目標神經元的合成照片，滾動鼠標輪軸可查看目標神經元各個層次的形態(tài)。

2.1.2 灰度轉換，Image→Type→8-bit

2.1.3 保存圖片，File→Save as→ConX200@06（*Tiff）

2.2 NeuronStudio軟件 2D圖片清晰化

由于合成的圖片較“厚”，遮住了目標神經元的細節(jié)，所以需借助圖像軟件“過濾”，是目標神經元輪廓更為清晰，這里使用NeuronStudio軟件進行圖像處理。

2.2.1 打開NeuronStudio，File→Open→ConX200@06，導入之前合成的那張圖片。

2.2.2 Run→Projections→Minimum

2.2.3 File→Save Projections

3．N euronJ測量分支數

3.1使用ImageJ打開之前處理好的圖片

3.2 設置標尺，在圖片標尺上畫一直線，Analyze→Set Scale→Known Distance(例：50) →unit of length(例：um) →勾選Global→OK

3.3 打開NeuronJ補丁，Plugins→NeuronJ

3.4 點擊打開圖片。

3.5 點擊，圖上出現一十字光標，右擊目標神經元胞體，開始追蹤神經元，沿著樹突方向移動鼠標，軟件會相應追蹤軌跡，如果軌跡偏離太遠，可回到樹突上，右擊確定軌跡。追蹤至該樹突末端，雙擊結束該條樹突的追蹤。如有軌跡有誤，需要刪除，則點擊，把鼠標放在該條軌跡上，該條軌跡會高亮，點擊高亮的軌跡，會有對話框提示是否刪除該軌跡，選擇確認刪除。用相同方法可追蹤勾勒出整個神經元各級樹突全貌（如下圖）。