1.測(cè)序結(jié)果文件
一般公司DNA測(cè)序結(jié)果都提供兩個(gè)文檔，一個(gè)是序列文檔(后綴為.seq)，一個(gè)是測(cè)序峰圖文檔(后綴.ab1)，為堿基的測(cè)序質(zhì)量信息。
(A).seq – 序列文件，TEXT的序列文檔，可由記事本或BioEdit打開。
(B).ab1－峰圖文件，可由BioEdit或Chromas打開察看。
2.切除兩端低質(zhì)量堿基
由于Sanger測(cè)序技術(shù)限制，每個(gè)測(cè)序反應(yīng)一般僅有800bp左右比較準(zhǔn)確。
一般測(cè)序結(jié)果的前端大約50個(gè)堿基的質(zhì)量會(huì)不好(測(cè)序引物的原因)，此部分測(cè)序峰圖通常無法判讀。這是正?，F(xiàn)象，需要把此部分堿基切除。同理，測(cè)序后期的堿基質(zhì)量也比較差(酶活降低與雜質(zhì)干擾較大等原因)，也需要把尾部測(cè)序峰圖不規(guī)則的堿基切除。因此留下中間堿基質(zhì)量相對(duì)較好(峰圖規(guī)則)的序列用于后續(xù)分析。
方法如下：
用 BioEdit 打開正向測(cè)序結(jié)果峰圖文件( ZB10100433 (yangpin1) 16SS(zidai)_Pw_G12.ab1),通過移動(dòng)左邊與左上角的比例標(biāo)尺，調(diào)整峰圖的高度與寬度，使DNA每個(gè)堿基的峰圖大小適合觀察。
從下圖看出，前面50多個(gè)堿基的峰較亂，此處選擇55個(gè)開始的堿基。同理，DNA末端由于酶活力下降等原因，測(cè)序質(zhì)量也逐步變差。根據(jù)峰圖的形狀，我們也需要切除尾部950bp后的堿基（約末端100bp），只保留56-950之間約900bp的高質(zhì)量堿基。
選擇 BioEdit 顯示DNA序列的子窗口(Window菜單->DNA sequence frome…)
然后在 BioEdit 的Sequence菜單->select positions,在彈出窗口中輸入56與950，點(diǎn)OK按鈕后，就以背景黑的顯示已選擇的序列。
再選edit菜單->Copy(或直接按Ctrl-C鍵)，復(fù)制序列到一個(gè)新的文本文件，保存為16S_rDNA.fas。增加序列的注釋行”>16SF”,代表正向測(cè)序序列。
同上步驟，根據(jù)峰圖信息，再復(fù)制另一個(gè)反向測(cè)序結(jié)果的高質(zhì)量序列(56-950)到文本文件16S_rDNA.fas，并標(biāo)記序列為”>16SR”，代表反向測(cè)序序列。
DNA測(cè)序通常需要兩個(gè)方向進(jìn)行，測(cè)序都是從DNA的5’端到3’端進(jìn)行的，正向和反向測(cè)序是指對(duì)DNA的兩條互補(bǔ)鏈分別測(cè)序。雙向測(cè)序結(jié)果經(jīng)校讀后完全一致才能認(rèn)為得到可靠DNA測(cè)序結(jié)果。
3.雙向測(cè)序序列的合并
通常PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，需要合并雙向序列，最終得到全長序列，這樣得到DNA序列比較準(zhǔn)確。
Bioedit打開前面保存的16S_rDNA.fas。
由于第二條序列是反向測(cè)序得到的DNA反向互補(bǔ)序列，需要通過先得到DNA的反向互補(bǔ)序列：Sequence->Nuleic Acid->Reverse Complement，再進(jìn)行比對(duì)。
利用BioEdit的alignment功能找重疊區(qū)域:Accessory application->ClustalW multiple alignment，使用默認(rèn)設(shè)置，比對(duì)結(jié)果顯示，中間重疊部分的序列大部分相似。
如果重疊區(qū)不是大部分相同堿基，請(qǐng)?jiān)囍岩粭l序列反向互補(bǔ)，再比對(duì)。
4.堿基的校準(zhǔn)
在上一步的比對(duì)結(jié)果窗口，先利用BioEdit得到兩條件序列合并后的一致序列：
修改堿基前，需要先把bioedit的Mode設(shè)置為”Edit”與”Insert”，并選中按鈕”view conservation plotting identities […] with a dot”，以點(diǎn)顯示相同的堿基，便于觀察差異位點(diǎn)。
在BioEdit中打開正向和反向測(cè)序結(jié)果的AB1文件和上面比對(duì)結(jié)果放同一窗戶(如圖)。
定位到差異堿基的位置（下圖黑色部分），一般可以在峰圖文件中查找不一致堿基（正反鏈錯(cuò)配、缺失或誤增堿基）及附近的幾個(gè)序列（點(diǎn)擊Edit菜單->find，或直接Ctrl-F），如查找GCAtAC。
注意反向測(cè)序峰圖的搜索，需要輸入序列的反向互補(bǔ)序列（GTtTGC）,小寫字母為不一致堿基。
查看該堿基及附近堿基正反測(cè)序峰圖形狀，判斷該堿基正確的堿基序列。
然后在序列窗口中分別改正正向16SF、反向16SR及Consensus序列中不一致的堿基。如有空格(gap)顯示為”-“，需要把三條序列同一位置上的堿基與”-“都刪除，才能保持后面的堿基比對(duì)結(jié)果正常(Backspace可刪除光標(biāo)前一個(gè)堿基)。
在BioEdit中打開正向和反向測(cè)序結(jié)果的AB1文件和上面比對(duì)結(jié)果放同一窗戶(如
5.保存序列
保存校正后的consensus序列，即為最終測(cè)序結(jié)果的合并序列。
選擇concensus序列->鼠標(biāo)右鍵:copy sequences
點(diǎn)擊file菜單->新建Aligment
點(diǎn)擊Edit菜單->paste sequence，并點(diǎn)擊concensus的標(biāo)題改為”16S_rDNA”
然后保存為16S_rDNA.fas（文件類型選擇Fasta格式）
