引 言

繼慢病毒、溶瘤病毒兩個(gè)系列專(zhuān)題后，從本期開(kāi)始以“CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)”為系列專(zhuān)題，分別從CRISPR/CAS9靶點(diǎn)活性檢測(cè)方法、CRISPR/CAS9-sgRNA文庫(kù)的設(shè)計(jì)和運(yùn)用以及CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展三個(gè)方面展開(kāi)。

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摘 要

“CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)，已經(jīng)作為一個(gè)常態(tài)化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)運(yùn)用于我們的平常實(shí)驗(yàn)中了，其中靶點(diǎn)的有效性驗(yàn)證至關(guān)重要，最為經(jīng)典的檢測(cè)方法則是T7E1酶切鑒定法，該方法對(duì)于切割效率較高的靶點(diǎn)，檢測(cè)效果明顯，而對(duì)敲除效率不高的靶點(diǎn)，則效果不佳。那么，針對(duì)敲除效率不高但又必須要敲除的靶基因，該如何進(jìn)行敲除效率檢測(cè)呢？本文介紹了一種基于基因組PCR產(chǎn)物的sanger法來(lái)判定靶點(diǎn)的敲除效率，其靈敏度遠(yuǎn)高于T7E1酶切法！”

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CRISPR/CAS9技術(shù)簡(jiǎn)介

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，是源于細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫防御，其作用是清除浸入菌體內(nèi)的病毒或非本體的DNA。后來(lái)經(jīng)過(guò)科學(xué)工作者的研究、改造和優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基因組進(jìn)行基因的敲除、敲入、激活或者抑制等操作的一項(xiàng)新的生物技術(shù)。

CRISPR的基本結(jié)構(gòu)由三個(gè)部分組成，即，一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個(gè)間隔區(qū)(Spacer)組成。（1）前導(dǎo)區(qū)(Leader)，位于CRISPR結(jié)構(gòu)的上游區(qū)域，序列長(zhǎng)度在300～500bp之間，其中AT含量較高是啟動(dòng)子序列；（2）重復(fù)序列區(qū)(Repeat)，序列長(zhǎng)度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（3）間隔區(qū)(Spacer)，該序列區(qū)穿插在重復(fù)序列區(qū)(Repeat)之間，序列長(zhǎng)度在26～72bp的之間。

CRISPR工作原理是CRISPR-derived RNA (crRNA) 通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA (trans-activating RNA) 結(jié)合形成 tracrRNA/ crRNA 復(fù)合體，此復(fù)合體招募CRISPR核酸酶聚集于crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處，并且對(duì)靶位點(diǎn)DNA雙鏈進(jìn)行切割，細(xì)胞通過(guò)同源修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂后的DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，研究者可根據(jù)同源修復(fù)機(jī)制的原理，設(shè)計(jì)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)對(duì)靶基因進(jìn)行編輯（如：去除和/或添加新基因）。

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T7E1酶切鑒定法

 T7 核酸內(nèi)切酶 I （T7E1）識(shí)別并切割不完全配對(duì) DNA、十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈 DNA。該酶切割錯(cuò)配堿基 5′ 端的第一、第二或第三個(gè)磷酸二酯鍵。

在CRISPR/CAS9陽(yáng)性克隆檢測(cè)中常會(huì)出現(xiàn)——假陽(yáng)性和弱陽(yáng)性。

假陽(yáng)性多由于T7E1酶識(shí)別了非CRISPR/CAS9切割修復(fù)導(dǎo)致的堿基錯(cuò)配，譬如，識(shí)別了十字交叉，holiday結(jié)構(gòu)等。

弱陽(yáng)性，主要是由于靶點(diǎn)gDNA的序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜或異常導(dǎo)致的。

• T7E1酶切法檢測(cè)突變體實(shí)驗(yàn)步驟  

1. PCR擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，長(zhǎng)度約500bp，突變位點(diǎn)最好不位于PCR片段中央，這樣將切割出兩條大小不同的帶。

2. 以混合克隆細(xì)胞株gDNA（或者突變體DNA與野生型DNA混合）為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，按如下體系進(jìn)行混合，進(jìn)行加熱變性、退火復(fù)性處理。

3. 上述產(chǎn)物用T7E1酶的酶切處理后（37℃水浴， 1h~1.5h），用2% agrose  DNA 電泳鑒定檢測(cè)。如可以切出兩條帶的為有效靶點(diǎn)，反之為無(wú)效靶點(diǎn)，有效靶點(diǎn)電泳如下圖。

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Sanger測(cè)序

Sanger法測(cè)序是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見(jiàn)DNA堿基序列的一種方法。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于DNA測(cè)序的技術(shù)主要有Frederick Sanger發(fā)明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method）。

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實(shí)戰(zhàn)：不一樣的CRISPR/CAS9靶點(diǎn)活性驗(yàn)證

針對(duì)目的基因或序列的sgRNA構(gòu)建完畢后，都需要進(jìn)行該位點(diǎn)的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于高敲除效率的靶點(diǎn)當(dāng)然不用擔(dān)心后續(xù)實(shí)驗(yàn)問(wèn)題（如下圖泳道2），但對(duì)于靶點(diǎn)敲除效率不高的咋辦呢？（如下圖泳道4）

對(duì)于假陽(yáng)性或弱陽(yáng)性是否有其他的檢測(cè)方法？

亦或是否有其他簡(jiǎn)潔、經(jīng)濟(jì)、有效的敲除效率檢測(cè)方法？ 

有！PCR產(chǎn)物Sanger測(cè)序！

1. A基因CON；2. A基因T7E1酶切；3.B基因CON；4. B基因T7E1酶切 ; 5.實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照。

• Sanger測(cè)序驗(yàn)證敲除有效流程

gDNA模板PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證法和用T7E1酶切的驗(yàn)證方法的前期實(shí)驗(yàn)和要求路線(xiàn)基本一致，PCR擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，長(zhǎng)度約500bp，突變位點(diǎn)最好不位于PCR片段中央，這樣將切割出兩條大小不同的帶。PCR結(jié)束后無(wú)需進(jìn)行退火等步驟直接用PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

• PCR產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)你所沒(méi)有發(fā)現(xiàn)

PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增時(shí)的正向或反向引物。

測(cè)序結(jié)果如下：

上行為gDNA序列，其中大寫(xiě)字母部分為靶點(diǎn)，下行為測(cè)序結(jié)果。這個(gè)結(jié)果比對(duì)，著實(shí)傷心！什么突變啊，什么敲除啊，啥子都沒(méi)有…………

咋辦？

不急再看看下面這個(gè)圖

紅色框部分為靶點(diǎn)序列，在靶點(diǎn)序列后面出現(xiàn)了雜峰，套峰！

這說(shuō)明什么？說(shuō)明這個(gè)靶點(diǎn)是有效的，此處，產(chǎn)生了切割、敲除、NHEJ……

喔喔喔……，看到了希望的曙光！

但是，這么低效率如何才能篩選出基因敲除的細(xì)胞呢？

• 病毒感染，絕處逢生

導(dǎo)致敲除效率不高的原因除了設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)效率不高外，還有就是sgRNA-CAS9轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的效率較低。將sgRNA-CAS9包裝進(jìn)入病毒載體，通過(guò)病毒感染目的細(xì)胞，提高sgRNA&CAS9的表達(dá)量，可以有效的提高CAS9蛋白對(duì)目的基因的切割效率。如下圖：

1.B基因CON；2. B基因T7E1酶切

由結(jié)果分析可以看出，用sgRNA-CAS9病毒載體感染細(xì)胞后，即使用T7E1酶切檢測(cè)的方法也可以明顯的檢測(cè)出基因的敲除效率。用gDNA模板PCR產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)方法，也可以通過(guò)峰圖中套峰的高低來(lái)判定sgRNA-CAS9的敲除效率。

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補(bǔ)充：系統(tǒng)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程，助力實(shí)驗(yàn)效率提升

通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)，可以很好節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，百澳笑笑生的實(shí)驗(yàn)流程如下：

說(shuō)明：

第4步，工具細(xì)胞內(nèi)（293T、HEPA1-6等）靶點(diǎn)敲除活性驗(yàn)證，本步驟旨在根據(jù)需要進(jìn)行敲除的細(xì)胞屬性（human、mouse等）選擇合適的、轉(zhuǎn)染效率較高的工具細(xì)胞，進(jìn)行靶點(diǎn)敲除效率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

第7步，目的細(xì)胞內(nèi)，靶點(diǎn)敲除活性驗(yàn)證，本步驟旨在復(fù)核驗(yàn)證靶點(diǎn)敲除的有效性，并對(duì)后期的單克隆細(xì)胞的篩選庫(kù)的數(shù)量做出預(yù)判，如果敲除效率較高，在后期的單克隆篩選時(shí)可以適當(dāng)減少篩選細(xì)胞數(shù)量，反之，則需要增加篩選細(xì)胞的數(shù)量。

第9步，單克隆細(xì)胞檢測(cè)，本步驟旨在檢測(cè)基因敲除的結(jié)果，看是否將目的基因KO，檢測(cè)不出其表達(dá)，通常用WB檢測(cè)。此處建議增加一個(gè)gDNA測(cè)序檢測(cè)，確認(rèn)獲得的KO細(xì)胞是純合子還是雜合子。如下圖：

B基因KO純合子（單峰）

B基因KO雜合子（套峰）