一、概述

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側，這一變化早于細胞皺縮、染色質濃縮、DNA片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。

AnnexinV是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。

因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

圖Annexin V 檢測細胞凋亡原理

二、試劑盒組份

三、實驗步驟

貼壁細胞需用0.25%的胰酶消化。注意過度消化可損傷細胞。在消化時可加2％的BSA可防止消化過度。如果用含EDTA的胰酶消化時，注意必須徹底清除EDTA：在標記前用1×PBS或1×bindingbuffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2＋螯合，影響Annexin V的結合。

（1）用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer；

（2）細胞收集。懸浮細胞收集：離心5分鐘；貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合），于室溫2000rpm離心5～10分鐘，收集細胞；

（3）細胞洗滌：用預冷1×PBS（4℃）重懸細胞一次，2000rpm離心5～10分鐘，洗滌細胞；

（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞；

（5）Annexin V-FITC標記：加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15分鐘；

（6）PI標記：上機前5分鐘再加入5μL的PI染色。

（7）上機前，補加200μL的1×Binding Buffer。

四、保存：

4℃保存；避免反復凍融。

五、注意事項

（1）本試劑只適用于實驗，不適用于臨床檢測；

（2）PI（propidium iodide，碘化丙錠）有毒性，能通過皮膚吸收，對眼睛有刺激作用，使用時需戴手套；

（3）Annexin V-FITC和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。在處理和標記時，盡可能在暗處進行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后，在暗室內用顯微鏡觀察；

（4）整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作，以免影響細胞狀態(tài)。

（5）在細胞洗滌的最后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會影響實驗結果。

（6）為防止熒光衰變，宜在1小時內進行流式檢測。

（7）PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進行Annexin V-FITC染色，最短可在上機前5分鐘再加入PI染色。、

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