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細胞凋亡的早期形態(tài)學改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片,細胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹,胞漿內(nèi)形成多個膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。 根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，至今為止，人們已經(jīng)設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。 一、光學顯微鏡觀察 凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。 本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標之一。 檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細胞計數(shù)。
本方法用于細胞培養(yǎng)，通過相差顯微鏡可動態(tài)觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長，出現(xiàn)釘狀突起，特續(xù)數(shù)小時后細胞膜破裂，細胞溶解，通過連續(xù)觀察，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。 檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。 雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。 缺點： (1)只能定性,不能定量; (2)標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標本檢測; (3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。 檢測方法：透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂毎櫩s、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。 由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準確地辨認凋亡細胞。 細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。 根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認凋亡細胞。 檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。 早期凋亡細胞及活細胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細胞的胞膜完整性受到破壞，細胞不需固定即可被PI染色。凋亡細胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側(cè)。另外，細胞凋亡時核酸內(nèi)切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進一步將染色質(zhì)裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA片斷。而壞死細胞DNA斷裂無規(guī)律性。 接下來我們來看看細胞凋亡的生物化學檢測方法。 一、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測方法 原理：在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。 AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。 碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。 因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。 檢測方法：1.按照既定程序誘導細胞凋亡；2.按照說明書配制所需溶液；3.常規(guī)制備單細胞懸液，用冷PBS洗兩次后，取約5×106個細胞，1500rpm離心，棄上清，將細胞懸浮在400 μl×結(jié)合溶液中；4.將細胞懸液分成5管，每管約1×106個細胞，陰性對照管不加任何試劑，陽性對照管加2%多聚甲醛固定30分鐘，用FITC標記Annexin V和PI雙染，余下3管，其中1管只加10 μl PI，1管只加5 μl FITC標記Annexin V，最后一管加10 μl PI和FITC標記Annexin V混合，室溫孵育15分鐘；5.每管各加400 μl 1× 結(jié)合緩沖液上機檢測。 注意事項：A.確定細胞凋亡發(fā)生的時間，PS外翻只發(fā)生在細胞凋亡早期，建議先觀察細胞凋亡的形態(tài)后決定取樣檢測時間；B.由于EDTA會絡合Ca2+離子，影響Annexin V與PS的結(jié)合，因此建議不用含EDTA的胰酶消化貼壁細胞。細胞經(jīng)過胰酶消化后可能導致胰酶對細胞的進一步作用從而導致細胞的進一步凋亡，建議在用胰蛋白酶處理前單獨收集培養(yǎng)液中懸浮的細胞，保存在2%的BSA中。 二、磷脂酰絲氨酸單抗（PS）檢測法 原理：與Annexin V相比，PS的抗體可以直接用來檢測細胞凋亡過程中PS的外翻，而且靈敏度高，特異性強，信號持續(xù)時間久，費用更低。 三、TUNEL法 原理：TUNEL的全稱是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP原位切口末端標記。 細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。 由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。 TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。 不足之處： (1)壞死細胞亦有DNA裂點形成,也可呈現(xiàn)TUNEL反應陽性，因而特異性較差。據(jù)報道，TUNEL反應中壞死細胞的標記量比凋亡細胞的標記量少一個數(shù)量級。 (2)TUNEL結(jié)合免疫組化檢測時，固定過程對檢測的影響較大，切片的大小、薄厚會直接影響到固定效果，從而產(chǎn)生結(jié)果的差異。 四、ISOL檢測法 原理：與TUNEL凋亡檢測法類似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段連接）也是通過末端標記斷裂DNA的方法。但該方法的創(chuàng)新在于利用ISOL方法，在DNA片段的平端或3’端單個突出堿基進行連接擴增，鑒于只有發(fā)生凋亡的細胞才會發(fā)生平端或3’端單個堿基突出，所以ApopTag 過氧化物酶ISOL凋亡檢測試劑盒能夠明確的區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞。 優(yōu)勢：原位特異標記，能夠最大限度的降低背景，克服TUNEL法檢測的假陽性，適用于石蠟包埋的組織、冰凍組織、貼壁細胞以及懸浮細胞的凋亡檢測。 五、DNA凝膠電泳(DNAladder) 凋亡過程中DNA裂解是標志細胞最終走向死亡的不可逆的重要過程，DNA凝膠電泳也曾被認為是細胞凋亡判定的金標準之一。抽提細胞的DNA,確定樣品中DNA的量和純度，然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正常活細胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶;細胞凋亡時，由于DNA被裂解成單個核小體和寡聚核小體，電泳時呈現(xiàn)特征性的“階梯狀”(ladder)條帶，壞死細胞的DNA是被隨機破壞的，不能形成階梯狀條帶，電泳時出現(xiàn)類似血涂片的連續(xù)性改變。此方法是判斷細胞有無凋亡發(fā)生的一種簡便方法，比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細胞的檢測。 缺點： (1)特異性較差，特征性的180～200bpDNA梯帶的出現(xiàn)并非凋亡所獨有，另外在某些罕見的情況下細胞發(fā)生凋亡可無DNA斷裂； (2)不能提供單個細胞或相關(guān)細胞的組織學定位或細胞分化等凋亡信息； (3)不能進行準確定量，只能進行半定量； (4)靈敏性較差，要求所測標本細胞數(shù)在1×106以上才能使電泳清晰； (5)適用于只含有單一細胞成分標本的測定，對組織細胞組成復雜者，不能確定凋亡發(fā)生于哪類細胞。 六、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定 ELISA是定量檢測細胞凋亡的免疫化學法，其基本原理是利用夾心ELISA方法檢測細胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA片斷組成的核小體。在微定量板上吸附抗組蛋白抗體，加入細胞裂解后離心所得的含有核小體的上清液，核小體上的組蛋白與包被的抗組蛋白抗體結(jié)合；加入辣根過氧化物酶標記的抗DNA抗體，與核小體上的DNA結(jié)合；加酶的底物，測光吸收值。此方法敏感性高，所需細胞數(shù)少，可檢測低至5×102/mL的凋亡細胞。此外，此方法不需特殊儀器，比較適合基層工作。 缺點： (1)不能精確測定凋亡發(fā)生的絕對量； (2)適合單一成分細胞的檢測，對于多細胞成分的組織或細胞混合物，不能判定凋亡發(fā)生在哪種細胞； (3)不能提供單個細胞或相關(guān)細胞的組織學定位。 |
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